A Fast Analytical LC/MS/MS Method for the Simultaneous Analysis of Barbiturates and 11-nor-9-carboxy-Δ9- tetrahydrocannabinol (THC-A) in Urine

Význam tématu

Analýza barbiturátů a metabolitu THC-A v moči je klíčová pro klinickou toxikologii, forenzní vyšetření a farmakokinetické studie. Díky vysoké citlivosti a přesnosti LC/MS/MS metod lze spolehlivě detekovat a kvantifikovat stopy těchto látek v biologických vzorcích, což podporuje diagnostiku, monitorování terapie a vyšetřování případů zneužití návykových látek.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vyvinout rychlou a spolehlivou LC/MS/MS metodu pro simultánní stanovení osmi barbiturátů (amobarbital, butabarbital, butalbital, methohexital, pentobarbital, phenobarbital, hexobarbital a secobarbital) a 11-nor-9-karboxy-Δ9-THC (THC-A) v lidské moči. Klíčovým prvkem je použití negativního režimu ESI a technologie střídavé regenerace kolony (alternating column regeneration, ACR) pro zvýšení průchodnosti analýz.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: 100 μL lidské moči s přídavkem vnitřních standardů. Kalibrace: maticově namatchované standardy v rozsahu 0,5–500 ng/mL pro amo/pentobarbital a THC-A, 5–1 000 ng/mL pro ostatní barbituráty.
Chromatografie: Agilent 1290 Infinity II UHPLC se dvěma čerpadly a dvoucestným 10portovým ventilem pro ACR. Kolony: 2× Agilent Poroshell 120 EC-C18 (2,1×100 mm, 1,9 μm). Mobilní fáze: voda/acetonitril s 5 mM amonným acetátem, gradientní eluce za 3 minuty při 0,35 mL/min.
Detekce: Agilent 6470 triple quadrupole MS s technologií Jet Stream v negativním režimu ESI. Kvantifikace metodou MRM s optimalizovanými přechody, fragmentory a energiemi kolize.

Hlavní výsledky a diskuse

Implementace ACR snížila dobu mezi injekcemi na 3,65 min (26% zkrácení oproti 5,0 min). Všechny analyty byly eluovány do 3 minut, izobarická dvojice amobarbital/pentobarbital zůstala nerozlišená za standardních podmínek (možné úpravy gradientu pro separaci). Kalibrační křivky vykazují excelentní linearitu (R²>0,995) v celém sledovaném rozsahu. Dolní limit kvantifikace (LLOQ) dosahuje 0,5 ng/mL pro amo/pentobarbital a THC-A, 5 ng/mL pro ostatní barbituráty. Reprodukovatelnost byla velmi dobrá (CV<15 %).

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zkrácení doby analýzy a zvýšení denní kapacity laboratoře díky ACR.
• Široký dynamický rozsah a nízké LLOQ vhodné pro forenzní a klinické aplikace.
• Jednoduchá příprava vzorků a robustní MRM kvantifikace umožňují rutinní provoz v QA/QC laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metody o další skupiny drog a jejich metabolity pro komplexní panely.
• Optimalizace chromatografických podmínek pro rozlišení izobarů a strukturálně podobných sloučenin.
• Testování vlivu různých matic a přípravných procedur na robustnost a citlivost metody.
• Integrace ACR v dalších aplikacích LC/MS/MS a plná automatizace workflow.

Závěr

Vyvinutá LC/MS/MS metoda spojuje rychlou analýzu osmi barbiturátů a THC-A s vysokou citlivostí a reprodukovatelností. Použití střídavé regenerace kolony významně zkracuje dobu analýz a zvyšuje průchodnost laboračního provozu, což podporuje aplikace v klinické toxikologii, forenzní praxi a monitorování terapie.

Reference

1. Workman H; Doyle RM. A Combined Method for the Analysis of Barbiturates and 11-nor-9-carboxy-Δ9-THC in Urine by LC/MS/MS. SOFT 2011, Poster.
2. Cichelli JL; Doyle RM. LC/MS/MS Analysis of Barbiturates in Urine, Oral Fluid and Blood. MSACL 2015, Poster.