Increasing reporting confidence in metabolomics; RP and HILIC LC-MS/MS analysis in multiple tissue studies

Význam tématu

Metabolomická analýza je klíčová pro pochopení biochemických procesů a dysregulací v různých tkáních. Diverzita polarity metabolitů představuje analytickou výzvu, kdy jediná chromatografická metoda nemusí zajistit dostatečné rozlišení ani vysoce polárních sloučenin. Kombinace RP a HILIC LC-MS/MS přináší širší pokrytí metabolomu a vyšší důvěru v identifikaci.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo srovnání standardizované RP LC-MS/MS metody se specificky vyvinutou HILIC metodou pro analýzu metabolitů v různých myších tkáních (mozek, játra, pankreas, střeva, plazma). Studie si kladla za cíl zvýšit spolehlivost hlášení, snížit falešnou objevitelnost (FDR) a rozlišit izobarické metabolitické funkce v komplexních vzorcích.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky: extrakty z mozku, jater, pankreatu, caeca, faeces, plazmy myší; rekonstituce ve 90 % acetonitrilu.
• Reverzní fáze: Acquity C18 BEH (2.1×100 mm, 1.7 μm), 50 °C, 0,4 mL/min, gradient voda/0,1 % FA – acetonitril/0,1 % FA, doba analýzy 35 min.
• HILIC: Shim-pack Velox HILIC (2.1×100 mm, 2.7 μm), 40 °C, 0,3 mL/min, gradient voda+10 mM ammonium formiát/0,1 % FA – acetonitril, doba analýzy 18 min.
• MS detekce: QTOF LCMS-9030, ESI pozitivní/negativní režim, m/z 60–1000, DIA-MS/MS (izolační šířka 35 Da, CE 5–55 V, cyklus 0,99 s).
• Software: LabSolutions Insight, porovnání s autentickými standardy v in-house knihovně.

Hlavní výsledky a diskuse

• RP metoda pokryla široké spektrum lipidů (LPC, LPE, mastné kyseliny, amidy) i některé polaritě středně afinní metabolity mezi 0,7–31 min.
• HILIC metoda selektivně oddělila vysokopolární sloučeniny (aminokyseliny, nukleotidy, aminokyseliny), integrita retencí se pohybovala pod 0,25 % RSD.
• Izobarické funkce m/z 118,0853 (valin, 5-aminopentanoát, norvalin, trimethylglycin) a m/z 146,1176 (acetylcholin, 4-trimethylammoniobutanoát) byly v HILIC jasně rozlišené v jednotlivých tkáních.
• Aplikace obou metod zvýšila důvěru v identifikaci metabolitů v komplexních vzorcích faecálních a caecálních extraktů a odhalila metabolické změny po aplikaci metronidazolu a chronickém podání ethanolu.

Přínosy a praktické využití metody

• Komplementární přístup RP + HILIC zajišťuje širší metabolomické pokrytí a lepší selektivitu pro vysoce polární sloučeniny.
• Snížení falešných pozitivních nálezů a zvýšení spolehlivosti dat je klíčové pro biomedicínské i farmaceutické aplikace.
• Metoda je vhodná pro rutinní QA/QC, studie mikrobiomu i průmyslovou analýzu tkání.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace více chromatografických režimů v jedné platformě pro komplexnější profil metabolitů.
• Automatizace datové analýzy s využitím pokročilých algoritmů strojového učení pro snížení chimerických spekter.
• Vývoj miniaturizovaných a vysoce propustných HILIC kol pro rychlejší screening a menší spotřebu vzorku.
• Rozšíření in silico knihoven a veřejných databází s kvalitními referenčními MS/MS spektry.

Závěr

Pro robustní a vysoce spolehlivou metabolomickou analýzu tkání je nezbytné kombinovat reverzní fázi a HILIC. RP LC-MS/MS poskytuje vynikající pokrytí lipidů, zatímco HILIC zvyšuje jistotu identifikace vysoce polárních metabolitů a umožňuje rozlišení izobarických isomerů. Tento komplementární přístup výrazně zlepšuje kvalitu a důvěryhodnost metabolomických dat.