UHPLC-Q-TOF MS-Based Profiling of Cell Culture Medium and Post-Culture Supernatant Combined with a Retention Time-Integrated Database

Význam tématu

Cell culture medium určuje mikroprostředí pro růst a funkci buněk in vitro a přímo ovlivňuje reprodukovatelnost experimentů, kvalitu biotechnologických produktů a úspěšnost buněčných terapií. Komplexní profilace složení média a metabolitů uvolněných buňkami je klíčová pro kontrolu kvality šarží, optimalizaci formulací, snížení nákladů a rychlé odstraňování problémů v kultivačních procesech. Retenční čas napojený na databázi zvyšuje spolehlivost identifikace isomerů a látek náchylných k in-source fragmentaci nebo špatnému chromatografickému chování (např. fosfátové sloučeniny).

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo vyvinout UHPLC-Q-TOF metodiku kombinovanou s databází obsahující retenční časy (>220 sloučenin) pro komplexní profilaci složení kulturálních médií a post‑kultivačních supernatantů. Studie zkoumá pokrytí výživných složek (aminokyseliny, vitaminy, cukry, organické aminy) a centrálních metabolických cest v buňkách (glykolýza, PPP, TCA) a porovnává dva typy media a odpovídající supernatanty z hlediska složení a metabolického fenotypu.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: čtyři vzorky (2 média: 1-1-M, 6-4-M; 2 supernatanty: 1-1-S, 6-4-S). Předehřívání: ředění do 80 % acetonitril/voda, centrifugace a analýza nadřazeného roztoku.

Chromatografie a MS (stručně):

• Režim LC: HILIC (pro zlepšení retence polárních metabolitů).
• UHPLC: Agilent Infinity III.
• Q-TOF MS: (označeno jako Revident) s AJS ion source, pozitivní i negativní režim skenování.
• Vybrané parametry ion source: Gas Temp ~300 °C, Drying Gas ~8 L/min, Nebulizer 0.3 mL/min, Vcap ~3500 V, Fragmentor ~110 V, Sheath gas temp ~325 °C, Sheath gas flow ~11 mL/min, Nozzle Voltage 500 V (pos) / 1000 V (neg).

Zpracování dat: PCDL (Personal Compound Database and Library) obsahující >220 sloučenin s retenčními časy použita pro cílené potvrzení složek; Agilent MassHunter Profinder B.10 pro analýzu komponent.

Hlavní výsledky a diskuse

Identifikace složek v médiu:

• Aminokyseliny: 21 identifikovaných, včetně všech 8 esenciálních (Leu, Ile, Phe, Val, Trp, Met, Thr, Lys) a 13 neesenciálních; nastavená metoda dokáže rozlišit isomery Leu a Ile chromatograficky.
• Vitaminy a koenzymy: 14 detekovaných (např. riboflavin, nicotinamid, NAD+, FAD, PLP atd.).
• Uhlíkaté zdroje: identifikovány tři typy cukrů (glukóza, pentóza, sacharóza).
• Organické aminy: ethanolamin/monoethanolamin, diethanolamin, trimethylamin.

Analýza metabolitů v supernatantu:

• Celkem 99 metabolitů pokrývajících široké kategorie: esenciální a neesenciální aminokyseliny, deriváty aminokyselin, vitaminy/koenzymy, glykolýzní a PPP metabolity, TCA cyklus, nukleosidy/báze, energetické intermediáty a cukry.
• Retenční časy v databázi výrazně pomohly vyloučit chybné identifikace způsobené in‑source fragmentací (příklad: špička u 4.5 min byla prokázána jako in‑source fragment malátu, nikoli fumarátu).
• Metody HILIC + optimalizace podmínek výrazně zlepšily tvar piků fosfátových sloučenin (příklad UMP s dobře definovaným tvarem), čímž se zvyšuje citlivost a kvantitativní přesnost pro energeticky významné molekuly.

Komparativní výsledky mezi 1-1 a 6-4:

• Obě média mají podobné kategorické zastoupení živin, ale 1-1 vykazovalo vyšší absolutní hladiny živin (aminokyseliny, vitaminy, cukry, aminy) a zvláště vyšší podíl esenciálních aminokyselin a organických aminů.
• Metabolicky aktivní fenotyp 1-1: silná aktivace pyrimidinové metabolizace (např. dU zvýšen 70,22×, cytosin 42,97×) a výrazné posílení TCA cyklu (citráty zvýšeny ~68×), spolu se zvýšením glykolýzy/PPP a metabolismu aminokyselin.
• Fenotyp 6-4: preferenční aktivace purinové metabolizace (inosin ~6,33×, cAMP ~3,10×), zvýšená glykolýza/glukoneogeneze (PEP ~4,43×) a vyšší hladina biotinu (~4,97×). UDP‑Glc bylo výrazně vyšší v 6-4, což souvisí s glykozylací při syntéze protilátek a má implikace pro výrobu antibody.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda poskytuje praktický nástroj pro:

• Kontrolu kvality a srovnání šarží kultivačních médií na úrovni jednotlivých živin a metabolitů.
• Optimalizaci formulací médií pro dosažení požadovaného metabolického fenotypu a zlepšení výtěžku bioterapeutik (např. protilátek) díky zjištění markerů glykozylace (UDP‑Glc) nebo zvýšeného nukleotidového metabolismu.
• Rychlé diagnostikování problémů v kultivaci díky identifikaci odchylek v metabolomice.
• Podporu designu experimentů (DoE) a dalších inženýrských zásahů do procesu výrobního škálování.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možnosti rozšíření a dalšího využití metody zahrnují:

• Integraci metabolomických dat s údaji o titru produktu (např. protilátky) pro korelační analýzu mezi složením média, metabolickým stavem buněk a výtěžností — cesta ke racionální optimalizaci kultivace.
• Rozšíření databáze RT o kvantitativní referenční křivky a stabilní izotopické interní standardy pro přesnou kvantifikaci.
• Automatizaci zpracování dat a nasazení v on‑line/near‑line monitoringu bioreaktorů pro řízení procesu v reálném čase.
• Vývoj cílených metod (SRM/MRM) založených na zjištěných biomarkerech pro rychlé rutinní sledování v QA/QC.
• Aplikace pokročilých technik (izotopové stopování, flux‑analýzy) k mapování metabolických toků a lepšímu pochopení efektu změn média na biosyntetické dráhy.

Závěr

Studie demonstruje, že kombinace UHPLC‑Q‑TOF analytiky s retenčně integrovanou databází umožňuje komplexní a spolehlivou profilaci složení kulturálního média i buněčných metabolitů. Metodika zvládá separaci isomerů, řeší problémy s fosfátovými sloučeninami a pomáhá odhalovat metabolické fenotypy spojené s různými formulacemi médií. Tyto informace mají přímé aplikační využití v optimalizaci formulací, kontrole kvality a zlepšování produkce bioterapeutik.

Reference

• Minghui Sun, Jia Tu, Yue Song, Jimmy Chan. UHPLC-Q-TOF MS-Based Profiling of Cell Culture Medium and Post-Culture Supernatant Combined with a Retention Time-Integrated Database. Poster Reprint, ASMS 2026, TP 249. Agilent Technologies Inc., Shanghai, China. Published June 30, 2026.