Increasing Throughput in Collision-Induced Unfolding Studies: Enhancing Sensitivity and Streamlining Set-up

Význam tématu

Collision-induced unfolding (CIU) je významná technika pro sledování konformačních změn a stability biomolekul a jejich komplexů. V biotechnologickém a farmaceutickém průmyslu se CIU uplatňuje při hodnocení stability domén proteinů, vazby ligandů, rozlišení proteoform a posuzování vlivu mutací. Zvýšení propustnosti a citlivosti CIU experimentů je klíčové pro jejich praktické nasazení v high‑throughput prostředích, například při screeningových studiích developability terapeutických protilátek.

Cíle a přehled studie / článku

Studie prezentuje dvě hlavní inovace implementované na hmotnostním spektrometru Cyclic IMS P20 s cílem výrazně zrychlit CIU workflow a zvýšit detekční citlivost: 1) nové dedikované režimy akvizice CIU HDMS a CIU HDMSMS pro rychlé a jednoduché nastavení experimentu; 2) použití Wideband Enhancement (WBE) ke zvýšení TOF duty cycle a tím i signálu, což umožňuje zkrácení doby běhu experimentů až přibližně 4×.

Použitá metodika a instrumentace

Hlavní instrumentace a softwarové nástroje použitá v práci:

• Cyclic IMS P20 Mass Spectrometer (Waters) se sekčním vysokorozlišovacím Cyclic ion mobility separátorem a TOF analyzátorem s rozlišovací schopností až 100 000 (FWHM).
• Volitelné moduly: Dynamic Field Declustering (DFD) pro odstranění aduktů/detergentů v nativním MS a elektronová zachycovací disociace (ECD) pro doplňkové fragmentační studie.
• Wideband Enhancement (WBE) funkce pro maximalizaci TOF duty cycle v režimu ion mobility.
• Ionizační zdroj: Waters Nanolockspray s nanoflow kapilárním adaptérem.
• Vzorky: Waters Humanized mAb mass check standard a streptavidin (Pierce).
• Softwarové nástroje: MassLynx v4.2 pro sběr dat a CIUSuite2 pro zpracování CIU fingerprintů.

Metodologicky byly zavedeny dva režimy akvizice CIU: CIU HDMS pro multiplexní měření a CIU HDMSMS pro izolaci a analýzu jedné nabité formy. Po nastavení počátečního napětí, velikosti kroku, počtu kroků a času na krok lze metodu vytvořit za méně než jednu minutu. Akvizice může běžet sekvenčně (každý krok za sebou) nebo paralelně (krok se cykluje scan-po-scan), přičemž paralelní režim otevírá možnosti online CIU integrace s chromatografií.

Hlavní výsledky a diskuse

Klíčové experimentální poznatky:

• Rychlé nastavení metod: nové CIU akviziční typy umožňují vytvoření metody až 15× rychleji než dřívější postupy — typicky pod jednu minutu pro kompletní konfiguraci rampy napětí.
• Zvýšení citlivosti pomocí WBE: WBE zvyšuje TOF sampling duty cycle více než 4×, což se promítlo do přibližně 4× vyššího signálu pro 15+ nabitý stav streptavidinu a více než 4× pro 26+ nabitý stav mAb standardu.
• Zkrácení doby běhu: díky zvýšené citlivosti lze potenciálně zkrátit dobu CIU experimentu až 4× při zachování srovnatelné kvality CIU fingerprintů.
• Režimy sekvenční versus paralelní akvizice: sekvenční režim provádí jednotlivé napěťové kroky za sebou, zatímco paralelní režim cykluje napětí scan-po-scan, což umožňuje kontinuální/závislou akvizici a otevírá možnost online CIU spojené s chromatografií.

Diskuse zdůrazňuje, že kombinace rychlé konfigurace, vyšší citlivosti a možnosti paralelního běhu značně zvyšuje propustnost CIU studií a rozšiřuje jejich praktické využití v rutinních screeningových aplikacích.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické přínosy implementovaných inovací:

• Zvýšená propustnost: možnost provedení většího počtu CIU experimentů za jednotku času, což je zásadní pro vyhodnocování velikých panelů látek nebo variant protilátek.
• Nižší požadavky na vzorek: vyšší citlivost s WBE umožňuje práci s menšími množstvími materiálu nebo rychlejší akumulaci signálu.
• Jednodušší a rychlejší nastavení: zkrácení času potřebného k vytvoření CIU metody zvyšuje efektivitu laboratoře a minimalizuje chyby při konfiguraci.
• Možnost online CIU: paralelní režim otevírá cestu k integraci CIU do LC-MS pracovních postupů pro automatizované, nativní nebo pseudo‑nativní analýzy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje a aplikace:

• Rozšíření online/in‑line CIU spojené s chromatografickými separacemi pro komplexní směsi a automatizovaný screening.
• Dále vylepšené režimy WBE a další optimalizace TOF duty cycle pro ještě vyšší citlivost a kratší doby analýz.
• Integrace rozšířených datových analytických nástrojů, včetně strojového učení, pro automatizované vyhodnocení CIU fingerprintů a korelaci konformací s funkcí nebo developability parametry.
• Větší využití kombinovaných experimentů (CIU + ECD/FRAGMENTACE) pro detailní mapování domén a vazebných míst.
• Standardizace protokolů CIU pro nasazení v QA/QC prostředích biofarmaceutického průmyslu.

Závěr

Implementace dedikovaných CIU akvizičních režimů a Wideband Enhancement na Cyclic IMS P20 významně zlepšuje rychlost a citlivost CIU analýz. Výsledkem je výrazné zvýšení průchodnosti experimentů (rychlejší tvorba metod o ~15×), a možnost zkrácení doby běhu až přibližně 4× díky zlepšenému TOF duty cycle. Tyto vlastnosti činí CIU přístupnější pro rutinní a high‑throughput aplikace v oblasti vývoje biologických léčiv a strukturální analytiky.

Reference

1. Elliott N, McCullough B, Marsden-Edwards E, Cooper-Shepherd DA. Increasing Throughput in Collision-Induced Unfolding Studies: Enhancing Sensitivity and Streamlining Set-up. Waters Corporation; 2026. Poster.