Overcoming Non-Specific Adsorption in Oligonucleotide HILIC Analysis: A Comparison of Passivation and MaxPeak™ High-Performance Surfaces Technology

Význam tématu

Oligonukleotidy jsou klíčové molekuly ve výzkumu i vývoji terapeutik, avšak jejich analytická charakterizace je často limitována nešpecifickou adsorpcí (NSA) na kovových površích chromatografického průtoku. NSA zhoršuje citlivost, tvar piků, přesnost kvantifikace a zvyšuje variability a carryover. Proto je důležité vyvíjet a ověřovat technická řešení, která minimalizují tyto interakce, aby byla zajištěna spolehlivá analýza oligonukleotidů v HILIC režimu bez závislosti na krátkodobých postupech jako jsou passivace nebo mobilní-fázové přísady.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo kvantitativně porovnat vliv povrchové chemie komponent chromatografického průtoku na NSA oligonukleotidů v HILIC separacích. Testovalo se čtyři konfigurace systému a kolony: tradiční nerezové (stainless‑steel) komponenty vs. povrchově upravené ACQUITY Premier komponenty vybavené technologií MaxPeak High‑Performance Surfaces (HPS). Předmětem byly homopolymerní oligonukleotidy (dT15–dT35) ze standardu MassPREP OST a dále směsně bazická, aplikativně relevantní sekvence. Klíčovým hodnotícím ukazatelem byla relativní percentuální recovery a reprodukovatelnost (RSD) před a po sérii passivačních injekcí.

Použitá metodika a instrumentace

Testovaný pracovní postup zahrnoval: 24hodinovou ekvilibraci kolony, šest pre‑passivation injekcí standardu, 20 passivačních injekcí při 2× koncentraci a šest post‑passivation injekcí standardu. Mobilní fáze byly jednoduché (A: voda, B: acetonitril, C: 50 mM amonný acetát pH 6,7) bez ion‑pairing činidel, aby se minimalizovalo maskování skutečných povrchových efektů.
Použitá instrumentace byla následující:

• Chromatografické systémy: ACQUITY Premier UPLC System a ACQUITY UPLC H‑Class PLUS System
• Kolony: ACQUITY Premier BEH Amide Column, 1.7 µm, 2.1 × 100 mm (p/n: 186009505) a ACQUITY UPLC BEH Amide Column, 1.7 µm, 2.1 × 100 mm (p/n: 186004801)
• Detektory: TUV a PDA (vlnová délka 260 nm), vzorkovací frekvence 10 Hz
• Podmínky: průtok 0,5 mL/min, teplota kolony 60 °C, teplota vzorku 10 °C
• Objemy injekcí: standard 2 µL (40 pmol/µL), passivace 20 µL (80 pmol/µL)
• Vials: Total Recovery Vials
• Informační systém: Empower 3.8.1 CDS

Popis passivačního protokolu: záměrné opakované injekce při vyšší koncentraci za účelem dočasné blokace reaktivních povrchových míst a posouzení stability této blokace během následných analýz.

Hlavní výsledky a diskuse

- Před passivací vykazovala konfigurace se stainless‑steel kolonou extrémní NSA: téměř úplné zadržení analyzátů (nedetekovatelné píky). To ukazuje, že i malé množství nerezových povrchů v oblasti fritů či spojů může mít fatální dopad na analýzu oligonukleotidů.
- Výměna kolony za ACQUITY Premier BEH Amide, i při zachování nerezového systému, dramaticky zlepšila detekovatelnost všech pěti sledovaných x‑merů, což naznačuje, že povrchová úprava kolony hraje dominantní roli při redukci NSA.
- Nejlepší souhrnné chování prokázala kombinace ACQUITY Premier System + ACQUITY Premier Column: out‑of‑the‑box recovery dT25 ~88 % (1. injekce) rostoucí na ~95 % po 6 injekcích; po passivaci následovala stabilizace na ~100 % recovery v prvních pěti injekcích s velmi nízkou variabilitou (0,3 % RSD pro dT25 přes šest post‑passivačních injekcí).
- Stejná Premier kolona instalovaná na nerezovém ACQUITY UPLC H‑Class PLUS systému vykázala horší startovací recovery (~67 %) a pomalejší stabilizaci (~77 % před passivací). Po passivaci sice došlo ke zlepšení, ale recovery klesalo v následujících injekcích (z 100 % na ~86 % do 6. injekce) a variability byly vyšší (5,7 % RSD).
- Passivace dočasně zlepšila výkon nerezových komponent, avšak efekt rychle degradoval při pokračujících injekcích, zvláště pokud nerezové povrchy zůstaly v průtoku. To potvrzuje, že passivace je jen krátkodobé řešení a neřeší základní problém povrchové reaktivity.
- Analýza aplikativně relevantní směsné sekvence (obsah A, C, G, T) na ACQUITY Premier platformě ukázala dobře rozložený symetrický hlavní pik bez známek adsorpční deformace. Retenční časy vykázaly RT %RSD ≤0,34 % a relativní plochy %RSD ≤0,05 % přes 12 injekcí, což dokládá vysokou robustnost platformy i při náročnějších sekvencích.
Interpretace: výsledky zdůrazňují kumulativní efekt všech analytem kontaktních povrchů. Kompozitní přístup (biokompatibilní materiály + povrchová úprava HPS) poskytuje nejstabilnější ochranu proti NSA, zatímco spoléhání se pouze na passivaci či pouze na kolonovou úpravu nemusí dlouhodobě zajistit reprodukovatelné výsledky.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšená spolehlivost kvantifikace oligonukleotidů díky minimalizaci ztrát adsorpcí.
• Snížení potřeby mobilněfázových přísad nebo častého kondicionování systému, což zjednodušuje workflow a snižuje potenciální interferenci s dalšími metodami (např. MS).
• Nižší carryover a lepší tvar piků umožňují přesnější detekci i sledování menších nečistot.
• Vhodné pro vývoj a QA/QC pracovních postupů v oblasti terapeutických oligonukleotidů a výzkumných aplikací, zejména tam, kde je požadována vysoká reprodukovatelnost.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření povrchově inženýrských technologií (např. HPS) do širší škály LC a LC‑MS platforem, včetně systémů určených pro vysoce modifikované nebo delší oligonukleotidy.
• Integrace optimalizovaných povrchů s MS‑přátelnými mobilními fázemi pro přímou hyphenaci HILIC‑MS bez kompromisů v citlivosti nebo reproducibilitě.
• Standardizace testovacích protokolů pro NSA v regulačně orientovaných QC pracovních postupech, aby se snížila variabilita mezi laboratořemi a přístroji.
• Vývoj povrchových úprav cílených pro další povrchově aktivní biomolekuly (např. peptidové konjugáty, aptamery, konjugované oliga) a pro aplikace s vysokými iontovými silami nebo extrémními pH.

Závěr

Komplexní řešení založené na povrchově upraveném hardwaru (ACQUITY Premier System + MaxPeak HPS) významně snižuje nešpecifickou adsorpci oligonukleotidů v HILIC analýzách. Passivace nerezových povrchů poskytuje pouze dočasné zlepšení, zatímco systémová povrchová úprava přináší trvalejší ochranu, vyšší recovery, lepší tvar piků a vynikající reprodukovatelnost. Pro spolehlivou analýzu oligonukleotidů doporučuje studie holistický přístup k řízení povrchových interakcí v celém průtoku.

Reference

1. Eckstein F. Phosphorothioates, Essential Components of Therapeutic Oligonucleotides. Nucleic Acid Ther. 2014;24(6):374–387. DOI:10.1089/nat.2014.0506.
2. Khvorova A, Watts JK. The Chemical Evolution of Oligonucleotide Therapies of Clinical Utility. Nat Biotechnol. 2017;35(3):238–248. DOI:10.1038/nbt.3765.
3. Gilar M, Stoll DR. Challenges and Solutions in Oligonucleotide Analysis, Part I: An Overview of Liquid Chromatography Methods and Applications. LCGC Int. 2025;2(7).
4. Apffel A, Chakel JA, Fischer S, Lichtenwalter K, Hancock WS. Analysis of Oligonucleotides by HPLC−Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal Chem. 1997;69(7):1320–1325. DOI:10.1021/ac960916h.
5. Crooke ST, Witztum JL, Bennett CF, Baker BF. RNA-Targeted Therapeutics. Cell Metab. 2018;27(4):714–739. DOI:10.1016/j.cmet.2018.03.004.
6. Goodchild J. Conjugates of Oligonucleotides and Modified Oligonucleotides: A Review of Their Synthesis and Properties. Bioconjug Chem. 1990;1(3):165–187. DOI:10.1021/bc00003a001.