Analysis of Fatty Acids in Polysorbate 80 Using High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) with Charged Aerosol Detection (CAD)

Význam tématu

Polysorbát 80 je široce používaný neiontový surfaktant v potravinářství, farmaceutickém i kosmetickém průmyslu. Jeho heterogenní složení mastných kyselin a absence silného chromoforu komplikují kontrolu kvality tradičními UV metodami. Spolehlivá, rychlá a reprodukovatelná kvantifikace jednotlivých mastných kyselin je kritická pro zajištění konzistence surovin a shodu s monografiemi (USP). HPLC s detekcí CAD nabízí alternativu k časově náročným refluxním postupům a GC‑FID, vhodnou pro rutinní QC.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout a validovat vysokopropustnou (high‑throughput) HPLC metodu s Charged Aerosol Detection (CAD) pro stanovení složení mastných kyselin v polysorbátu 80. Studie optimalizovala klíčové parametry CAD (power function value, filtraci časové konstanty, teplotu odpařovače), chromatografické podmínky a postup přípravy vzorku tak, aby metoda poskytla citlivost, linearitu a opakovatelnost vhodnou pro použití v kontrolách kvality.

Použitá metodika

Popis postupu přípravy vzorku:

• Rozpouštěcí/​saponifikační krok: polysorbát 80 připraven v 90:10 směsi 1 M KOH/methanol (1,5 mg/mL) a inkubován 6 h při 40 °C pro uvolnění mastných kyselin (saponifikace).
• Následné zakyselování 50 µL 100% kyseliny mravenčí (formiové) a extrakce 500 µL MTBE; víření, odstředění 2700 rpm 5 min.
• Sbírání organické vrstvy, vysušení dusíkem a rekonstituce v 75:25 acetonitril/voda (v/v).

Chromatografické podmínky (shrnutí):

• Kolona: XBridge BEH C18, 4.6 × 100 mm, 3.5 µm, teplota 60 °C.
• Mobilní fáze: A = 0.05 % kyseliny mravenčí ve vodě, B = 0.05 % kyseliny mravenčí v acetonitrilu.
• Průtok: 1.5 mL/min; injekční objem: 35 µL; teplota autosam. 10 °C; gradientní program pokrývá rychlý rozdělovací běh umožňující separaci běžných mastných kyselin (C14–C18, nasycené i nenasycené).

Detekce a optimalizace CAD (klíčové parametry):

• Detektor: Waters Charged Aerosol Detector řízený Empower Software.
• Nastavení CAD: power function value (PFV) 1.00 (zejména pro dosažení dobré linearity), vzorkovací frekvence 10 pts/s, filter time constant 1.4 s (optimalizováno pro nejlepší S/N), ion trap voltage 20 V.
• Teplota odpařovače optimalizována na 25 °C pro maximální signál; vyšší teploty snižovaly odpověď.

Použitá instrumentace

• Arc HPLC systém s ohřívačem/chladičem kolony a aktivním předohřevem (Waters).
• Kolona XBridge BEH C18, 4.6 × 100 mm, 3.5 µm.
• Waters Charged Aerosol Detector (CAD).
• Software pro akvizici a zpracování dat: Empower 3.6.0.

Hlavní výsledky a diskuse

Citlivost a LOQ:

• Limit kvantifikace (LOQ) určen na základě S/N ≥ 10: hodnoty LOQ pro jednotlivé mastné kyseliny se pohybovaly v rozmezí přibližně 0.9–3.5 ng na kolonu.

Lineárnost a PFV:

• Lineární rozsah testován 0.05–25 µg/mL; použití PFV = 1.00 výrazně zlepšilo linearitu (R2 ≥ 0.99 pro většinu kyselin), s výjimkou myristové kyseliny, u níž byla linearita méně ideální.

Optimalizace filtrace a teploty:

• Filter time constant 1.4 s poskytl nejvyšší poměr signál/šum pro testované koncentrace (vzorek 0.5 µg/mL).
• Nižší teplota evaporátoru (25 °C) vedla k vyššímu signálu než vyšší teploty.

Opakovatelnost a systémová způsobilost:

• System suitability: 10 opakovaných injekcí standardu 10 µg/mL vykázalo velmi nízkou variabilitu: %RSD ploch ≤ 0.48 % a %RSD retenčních časů ≤ 0.02 %.

Identifikace složek a složení polysorbátu 80:

• Metoda rozlišila hlavní mastné kyseliny: linolenová (18:3), myristová (14:0), palmitoleová (16:1), linolová (18:2), palmitová (16:0), olejová (18:1) a stearová (18:0).
• Byl detekován doplňkový píek za olejovou kyselinou, identifikovaný po nasycení standardem jako petroselinová kyselina; složení mastných kyselin v analyzovaných partiích vyhovělo kritériím USP po započtení petroselinové kyseliny.

Přínosy a praktické využití metody

• Metoda umožňuje rychlé a citlivé stanovení mastných kyselin v polysorbátu 80 bez potřeby časově náročné refluxní přípravy a GC‑FID analýzy, což zvyšuje throughput v kontrolách kvality.
• CAD poskytuje robustní detekci pro analyty bez silného chromoforu a po digitalní úpravě signálu (PFV) dokáže dosáhnout vhodné linearity pro kvantifikaci.
• Vysoká opakovatelnost a kompatibilita s Empower dělají metodu vhodnou pro rutinní QC a dokumentaci v rámci farmaceutických postupů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření aplikace: adaptace metody na jiné typy polysorbátů nebo surfaktantů a na další nechromoforové lipidické komponenty v surovinách a hotových formách.
• Automatizace přípravy vzorků a vysoko‑propustné platformy pro zvýšení efektivity při analýze velkého počtu šarží.
• Integrace s hmotnostní spektrometrií pro strukturální potvrzení neobvyklých mastných kyselin a lepší identifikaci neznámých špiček.
• Regulační přijetí: metoda by mohla sloužit jako alternativní způsob k USP postupům při prokázání shody surovin, pokud budou doloženy přesnost a meze spolehlivosti.

Závěr

Vyvinutá HPLC‑CAD metoda nabízí efektivní a reprodukovatelný přístup ke kvantifikaci mastných kyselin v polysorbátu 80. Optimalizace CAD parametrů (PFV, filter time constant, teplota evaporátoru) a chromatografických podmínek vedla k nízkým LOQ, dobré linearitě a výborné opakovatelnosti. Metoda představuje praktickou alternativu k tradičním GC‑FID postupům vhodnou pro rutinní QC v průmyslovém prostředí.

Reference

1. Ilko D, Braun A, Germershaus O, Meinel L, Holzgrabe U. Fatty Acid Composition Analysis in Polysorbate 80 with High Performance Liquid Chromatography Coupled to Charged Aerosol Detection. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 94 (2015) 569-574.
2. Maziarz M, Harden S, Rainville R. Determination of Fatty Acid Composition in Polysorbate 80 using HPLC with Charged Aerosol Detection. Waters Application Note 720009340, 2026.
3. USP Monograph for Polysorbate 80, United States Pharmacopoeia, USP–NF 2021 Issue 1. The United States Pharmacopoeia Convention, Official 01-May-2020.