Screening to Confirmation: Complete Workflow for Comprehensive Forensic Toxicology Analysis Using a Single Software Platform

Význam tématu

Forenzní toxikologie vyžaduje rychlé a spolehlivé screeningové i potvrzovací analýzy širokého spektra látek v biologických matricích. Integrace screeningových (není-li vyžadováno předem definované cílové okno) a cílených konfirmací do jedné softwarové platformy snižuje složitost pracovního postupu, zkracuje dobu zpracování dat a minimalizuje riziko chyb způsobených přepínáním mezi nástroji a balíčky. To je kritické pro soudní laboratoře, klinická vyšetření a kontrolu drog v provozech.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat kompletní workflow „screening-to-confirmation“ pro forenzní toxikologii v jediném softwarovém prostředí LabSolutions Insight Explore od Shimadzu. Autoři ukazují kombinaci LC-QTOF pro nenamátkové (untargeted) screeningové skeny s následnou kvantifikací a potvrzením pomocí LC-MS/MS (MRM) a GC-MS (SIM/scan), přičemž celá analýza i zpracování výsledků probíhá v jedné platformě.

Použitá instrumentace

• LCMS-9050 (Q-TOF) pro nekteré screeningové (DIA / full scan) analýzy.
• LCMS-8050RX (Triple Quadrupole / TQ) pro cílenou kvantitativní analýzu v režimu MRM.
• GCMS-QP2020NX (Single Quadrupole) pro potvrzovací analýzy v režimech Scan a SIM.
• Kolony: Shim-pack Scepter PFPP-120 (1.9 µm, 2.1 x 50 mm) pro LC separace; Rtx-5ms (30 m x 0.25 mm, 0.25 µm) pro GC.
• Software: Shimadzu LabSolutions Insight Explore (Analyze, Explore, Insight modules) pro integraci akvizice, knihoven, zpracování a reportování.

Použitá metodika

• Vzorkování a příprava: biologické matrice (např. moč, krev) podstoupily extrakci, cleanup a přídavek interních standardů (více než 20 ISTD pro cílovou sadu).
• Screening: LC-QTOF s rychlým pětiminutovým chromatografickým během a datově nezávislou akvizicí (DIA) pro netargetované vyhledávání příznaků; detekce MS1 i MS2 a vyhledávání ve spektroskopických knihovnách (Cayman, Shimadzu forensic DB).
• Cílení / konfirmace LC: LC-MS/MS TQ v režimu MRM pro kvantifikaci 46 analytů za méně než 3 minuty s rychlým přepínáním polarity a použitím 23 interních standardů; kvantifikace na lineárních křivkách s vážením 1/C2 a akceptačními kritérii ±20 % pro repliky.
• Cílení / konfirmace GC: GC-MS v kombinaci Scan/SIM pro vyčleněnou skupinu >50 cílových látek (barbituráty, benzodiazepiny, opiáty atd.); parametry GC: program 60 °C (2 min) → 320 °C @ 15 °C/min, split 75:1, EI, scan 45–500 m/z a SIM eventy.
• Zpracování dat: funkce knihovny (včetně Reverse Search), import knihoven z různých formátů, automatická detekce peaků, formula finder, skórování hitů, a možnost prohlížení/flagování výsledků pro rychlou revizi a priorizaci.

Hlavní výsledky a diskuse

• Chromatografické rozlišení izobarů: autorům se podařilo baseline rozlišit páry isobarů morphine/hydromorphone a codeine/hydrocodone, což je klíčové pro správnou identifikaci v forenzních případech.
• Rychlost analýzy: LC běhy s dobou 5 minut umožnily velmi rychlý screening; LC-MS/MS konfirmace 46 analytů s 23 ISTD byla provedena za méně než 3 minuty.
• Kvantifikace a limity: byly vybudovány lineární kalibrační křivky s vážením 1/C2; uvedené hodnoty LLOQ se pohybují od nízkých pg–ng/mL (např. amphetamine 0,01 ng/mL; některé opioidy 0,1 ng/mL až 1 ng/mL) a R2 typicky ≥0,99 pro většinu analytů, což indikuje vysokou linearitu metody.
• Knihovní shody: příkladové library searchy ukazují shodu Methadone se 97% similarity indexem a Tramadolu 89%, čímž platforma prokázala dobrou schopnost identifikace i v komplexních maticích.
• Detekce v mixech: v TIC opiátového mixu bylo identifikováno více než 10 sloučenin; SIM režim byl úspěšně integrován se scan módem pro zvýšení citlivosti cílových analyz.
• Rozsah cílových látek: metoda byla ověřena na široké škále skupin včetně opiátů, stimulantů, benzodiazepinů, barbiturátů, fentanylů a nových syntetických opioidů (carfentanil, protonitazene, metonitazene) s použitím selektivních izotopově značených ISTD.

Přínosy a praktické využití metody

• Jednorázová softwarová integrace: centralizované zpracování akvizice, knihovních párování a reportingu zjednodušuje operace a snižuje dobu od vzorku k výsledku.
• Flexibilita workflow: kombinace untargeted QTOF screeningů a cílených MRM/SIM konfirmací umožňuje detekci neznámých látek a následnou citlivou kvantifikaci potvrzených nálezů.
• Vysoká propustnost: pětiminutové běhy a rychlé konfirmace výrazně zvyšují kapacitu laboratoře při zachování spolehlivosti výsledků.
• Zvýšená jistota identifikace: použití několika knihoven (a reverzního vyhledávání) spolu s MS1/MS2 daty zvyšuje důvěryhodnost při rozhodování o dalším postupu (např. potvrzovací testy, forenzní zpráva).

Budoucí trendy a možnosti využití

• Validace v reálných matricích: autoři navrhují další ověření, zejména stanovení recoveries u moče a krevních vzorků pro GCMS metodiku, aby byla plně validována pro rutinní použití.
• Rozšíření knihoven: kontinuální doplňování spektrálních knihoven o nové syntetické drogy a jejich metabolity zlepší identifikaci emergentních látek.
• Pokročilá data mining a AI: integrace strojového učení pro automatické priorizování podezřelých signálů a zlepšení skórování hitů může dále zrychlit rozhodování.
• Retrospektivní analýza: uchovávání plných QTOF dat umožní zpětné vyhodnocení starších běhů při objevení nového analytu bez nutnosti znovuanalýzy vzorku.
• Standardizace workflow: širší adopce jednotné platformy by mohla vést k lepší komparabilitě mezi laboratořemi a jednodušší implementaci regresních a mezinárodních standardů.

Závěr

Studie úspěšně ukazuje, že propojení LC-QTOF pro nenamátkový screening s LC-MS/MS a GC-MS pro konfirmaci v jediné softwarové platformě je funkční a praktické řešení pro forenzní toxikologii. Workflow poskytuje rychlé separace (5 min LC běhy), nízké LLOQ, vysokou linearitu kalibrací a spolehlivé knihovní shody. Před zavedením do rutinní praxe je však nutné provést kompletní validaci v konkrétních biologických matricích. Implementace takového integrovaného přístupu přináší výhody v podobě zjednodušení operací, zvýšení propustnosti a vyšší konzistence výsledků.

Reference

1. Hiramatsu Y., Matos Mejías C., Monti S. A., Smith J. P., Wiest L., Gilles C. Screening to Confirmation: Complete Workflow for Comprehensive Forensic Toxicology Analysis Using a Single Software Platform. Shimadzu Scientific Instruments, Inc., Columbia, MD.