Beyond the box: A ready-to-run workflow for quantitating 80 drugs of abuse in whole blood with the TSQ Certis Triple Quadrupole MS

Význam tématu

Rychlé, citlivé a reprodukovatelné stanovení látek zneužívaných v krvi je klíčové pro forenzní toxikologii a klinická vyšetření. Laboratoře čelí tlaku na vyšší průtok vzorků, přitom musí zachovat nízké limity kvantifikace, široké pokrytí analyzovaných sloučenin a spolehlivost výsledků. Popisovaný workflow kombinuje zjednodušenou přípravu vzorku, ultrarychlou chromatografii a optimalizovanou SRM detekci na trojitém kvadrupólu, čímž nabízí praktické řešení pro vysoce propustné toxikologické provozy.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem technické poznámky bylo vyvinout a předvést hotový kvantitativní postup pro 80 často se vyskytujících drog a léků v celém krevním matrice. Hlavní požadavky zahrnovaly minimální manipulaci se vzorky, krátkou chromatografickou dobu (4,5 minuty), schopnost polarity switching a robustní výkon pro analýzu stovek vzorků denně na přístroji Thermo Scientific TSQ Certis MS v kombinaci s Vanquish Flex UHPLC.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika přípravy vzorku:

• Vzorek: 100 µL lidské celé krve (negativní matrice) s přídavkem interních standardů (15 µL).
• Soft crash: 25 µL 1 % roztoku ZnSO4, vortex 15 s.
• Proteopresipitace: přidání 300 µL acetonitrilu, vortex 60 s.
• Čištění: INTip™ Filtration s Tip-on-Tip™ (ToT) technologií (DPX Technologies) — aspirace krashovaného vzorku do běžného pipetového hrotu a jeho převedení přes nízkoporézní filtrační hrot do čisté zkumavky.
• Sušení: 50 °C, 14 minut; rekonstituce: 20 µL MeOH (0.1 % HCOOH + 2 mM NH4HCOO) následované 80 µL vody (0.1 % HCOOH + 2 mM NH4HCOO) — pořadí přidání MeOH jako první je důležité pro udržení THC v roztoku.

Chromatografie:

• Sloupec: Thermo Accucore Biphenyl, 2.1 × 50 mm, 2.6 µm.
• Mobilní fáze: A = voda s 0.1 % HCOOH + 2 mM ammonium formate; B = methanol s 0.1 % HCOOH + 2 mM ammonium formate.
• Injektovaný objem: 1 µL; celkový běh: 4,5 minuty (rychlý gradient umožňující rozlišení izomerů jako codeine/hydrocodone, morphine/hydromorphone, methamphetamine/phentermine).

Mass spectrometry (MS):

• Přístroj: Thermo Scientific TSQ Certis Triple Quadrupole MS s OptaMax Plus HESI zdrojem.
• Režim: SRM (kvantitativní a potvrzovací přechody pro každý analyte).
• Výchozí parametry zdroje: napětí +3,500 V (pozitivní), −2,500 V (negativní), sheath gas 50, aux gas 10, sweep gas 1, ion transfer tube 325 °C, vaporizer 500 °C (vyšší teploty významně zlepšily citlivost).
• Q1 rozlišení 0.7 FWHM, Q3 1.2 FWHM; rychlost akvizice >900 SRM/s s polarity switching <5 ms; minimální dwell time ~2.16 ms.

Software a zpracování dat:

• Thermo TraceFinder v5.2 s nástrojem Method Forge pro automatickou extrakci target listu z jediného raw souboru a vytvoření master metody (úspora času při sestavování SRM seznamů a parametrů).

Použitá instrumentace

• Vanquish Flex UHPLC System (Thermo Scientific).
• Accucore Biphenyl column, 2.1 × 50 mm, 2.6 µm (Thermo Scientific).
• TSQ Certis Triple Quadrupole Mass Spectrometer (Thermo Scientific) s OptaMax Plus HESI source.
• INTip™ Filtration a Tip-on-Tip™ (ToT) technology (DPX Technologies) pro rychlé filtrační čištění.
• TraceFinder Software v5.2 (Thermo Scientific) pro automatizovanou tvorbu metod a kvantitativní zpracování.

Hlavní výsledky a diskuse

• Pokrytí: 80 látek – široké spektrum opioidů, benzodiazepinů, stimulantů, barbiturátů, antidepresiv atd. (75 v pozitivním, 5 v negativním ionizačním režimu).
• Citlivost: LOQ dosahovaly až 0.05 ng/mL; horní lineární mez ULOL až 500 ng/mL pro většinu analytů (konkrétní LOQ/ULOL pro jednotlivé analyty uvedeny v příloze metody).
• Rychlost: chromatografická doba 4.5 minuty → potenciál ~320 vzorků/den při plném provozu.
• Robustnost: více než 450 injekcí extrahovaných vzorků se zachováním stabilních oblastí píků (např. lorazepam v rámci ±20 % RSD), což potvrzuje robustnost workflow pro vysokopropustné rutinní nasazení.
• Citlivost byla dále zvýšena použitím vyšší teploty vaporizeru (až 500 °C) — až 2× vyšší peak area pro vybrané analyty.
• Separační výkon umožnil rozlišení klíčových izomerů v rámci krátkého běhu, důležité pro správnou identifikaci a kvantifikaci v forenzních případech.

Diskuse: Kombinace jednoduché proteinové precipitace s následnou nízkoporézní filtrací poskytla rychlé a efektivní čistění vzorku bez složitého SPE. Vysoká akviziční rychlost přístroje a krátké dwell časy umožnily sledovat velké množství SRM přechodů bez ztráty datového bodování chromatografických píků. Přesto je nutné standardní forenzní ověření a validační kroky při nasazení do klinické/právní praxe kvůli možným maticovým efektům a legalizačním požadavkům.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zrychlení analýzy umožňuje laboratořím výrazně zvýšit kapacitu testování (stovky vzorků denně) bez kompromisu citlivosti.
• Minimalizovaná příprava vzorku (100 µL krve, jednoduchý crash + filtrace) snižuje čas operátora a spotřebu spotřebního materiálu.
• Automatizovaná tvorba metod a správa target listů v TraceFinder zkracuje čas potřebný pro validaci a nasazení nových panelů látek.
• Metoda je vhodná pro forenzní a klinické labouratoře vyžadující rychlé screeningové a kvantitativní výsledky s potvrzujícími přechody (SRM).

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další rozšíření panelů včetně nových designovaných drog (NPS) a metabolitů s využitím širších knihoven SRM nebo vysokorozlišovací MS pro screening bez nutnosti množství SRM přechodů.
• Integrace plně automatizovaných front-end řešení (robotizace pipetáže, online SPE) pro další zvýšení throughputu a konzistence.
• Větší využití stabilně izotopovaných interních standardů pro kompenzaci matrix efektů a zvýšení kvantitativní přesnosti.
• Pokročilá softwarová řešení (machine learning) pro automatizovanou kontrolu kvality dat, detekci anomálií a rychlejší reporting do LIMS.
• Optimalizace pro menší vzorkové objemy a alternativní matrice (plazma, sucho na kartě) pro rozšíření aplikací.

Závěr

Popsaný workflow kombinuje jednoduchou a rychlou přípravu vzorku s výkonnou UHPLC separací a rychlým SRM na trojitém kvadrupólu, což umožňuje kvantifikaci 80 látek zneužívaných v celém krevním vzorku během 4,5 minuty. Metoda dosahuje LOQ až 0.05 ng/mL, ukazuje vysokou robustnost při stovkách injekcí a nabízí praktické řešení pro forenzní a klinické laboratoře usilující o vysokou propustnost bez ztráty kvality dat. Při nasazení do rutinní praxe je doporučená další validační studie zaměřená na maticové efekty, mezilaboratorní porovnání a právně závazné kritéria akceptace.

Reference

• Technická poznámka Thermo Fisher Scientific TN004362-EN, 2026: Beyond the box: A ready-to-run workflow for quantitating 80 drugs of abuse in whole blood with the TSQ Certis Triple Quadrupole MS.