Coupling AP-SMALDI MS Imaging technology with a modified Orbitrap Hybrid mass spectrometer

Význam tématu

Atmosférická AP-SMALDI (scanning microprobe MALDI) hmotnostní spektrometrie zobrazování (MSI) v kombinaci s Orbitrap technologií přináší vysoké prostorové i hmotnostné rozlišení a citlivost nezbytné pro lokalizaci nízkoabundance metabolitů, lipidy a xenobiotik v tkáních. Schopnost provádět souběžně MS1 i MS2 zobrazování v jednom surovém souboru usnadňuje jistou identifikaci látek přímo v kontextu tkáně, což je zásadní pro farmakokokinetiku, farmakodynamiku a biologické zobrazování na buněčné úrovni.

Cíle a přehled studie

Autoři prezentují integraci AP-SMALDI5 AF iontového zdroje s novou generací Orbitrap hybridního spektrometru (Thermo Scientific Orbitrap Excedion) a demonstrují jeho schopnosti v aplikacích MSI. Cílem bylo ukázat dosažitelné prostorové rozlišení bez oversamplingu, kvalitu MS1/MS2 dat a snížení in-source fragmentace díky upravenému iontovému trychtýři (ion funnel).

Použitá instrumentace

• Iontový zdroj: AP-SMALDI5 AF (TransMIT GmbH).
• Hmotnostní spektrometr: Thermo Scientific Orbitrap Excedion (Orbitrap Excedion Pro a Excedion MS varianty zmiňovány).
• Matrix aplikace: SMALDIPrep (TransMIT) pro pneumatiské nanášení DHB; také CHCA a DHB použity v klasickém dried-droplet preps.
• Software pro generování obrazů: TransMIT MIRION.
• Dodatečně: pro ověření měkkosti trychtýře byly použity i MassTech AP/MALDI UHR ion source u některých experimentů.

Použitá metodika

Popisovaná metodika kombinuje AP-SMALDI MSI se schopností Excedion platformy snímat MS1 a cíleně (tMS2 / ddMS2) MS2 spektra v rámci jedné akvizice. Vzorky zahrnovaly zamražené kryosekce zdravé myší mozkové tkáně (cerebellum), kryosekce parazitárních červů (Fasciola hepatica) ošetřených imatinibem a gelatinou embedované Schistosoma mansoni ošetřené zotatifinem. Pixel size při MS1 snímání dosahovala až 5 µm (MS1 mezi-sken 5 µm), dále byly provedeny akvizice s 20 µm pixelem s prokládanými MS2 skeny z přilehlých pixelů (10 µm krok pro MS1 a tMS2). Matrix DHB byla nanesena SMALDIPrepem; pro kontrolní experimenty byly použity i CHCA podle běžných protokolů.

Hlavní výsledky a diskuze

• Prostorové rozlišení: MS1 zobrazování cerebella zdravé myši dosáhlo 5 µm pixel size, což umožnilo vizualizaci jednotlivé vrstvy Purkinje buněk mezi molekulární a granularní vrstvou.
• MS1/MS2 v jednom souboru: Demonstrace souběžného záznamu MS1 obrazů a cílených MS2 (tMS2) umožnila potvrdit lokalizaci léčiv v tkáni (imatinib ve Fasciola hepatica; zotatifin ve Schistosoma mansoni) bez nutnosti další destruktivní analýzy.
• Retrospektivní MS2: MS2 spektra byla v některých případech získána retrospektivně ze stejného vzorku po dvou měsících, protože matrix (DHB) zůstala stabilní a umožnila dodatečné profilování.
• Snížená in‑source fragmentace: Upravený ion funnel Excedion platformy vykazoval výrazně nižší míru MS1 fragmentace (porovnáno s trychtýřem Exploris 480), což snižuje falešně pozitivní interpretace a zlepšuje korelaci s ESI daty; tento efekt potvrzen i experimenty s aminokyselinami (fenylalanin, isoleucin) a různými RF-nastaveními funnelu.
• Matrices a kolizní ochlazování: Různé matrice (DHB vs CHCA) vykazovaly podobné relativní poměry fragment/překursor pod AP podmínkami, což naznačuje, že volba matrixu není primárním faktorem pro MS1 fragmentaci při použití měkkého ion-funnelu.

Přínosy a praktické využití metody

• Vyšší prostorové a hmotnostné rozlišení pro lokalizaci molekul na buněčné úrovni (např. Purkinje buňky).
• Schopnost potvrdit přítomnost xenobiotik (léčiva) v konkrétních orgánech/strukturách přímo v tkáňovém kontextu pomocí MS2 bez nutnosti samostatných standardů nebo separátního LC-MS.
• Snížení artefaktů z in‑source fragmentace zvyšuje spolehlivost mapovaných signálů a usnadňuje interpretaci dat v farmakologických a biologických studiích.
• Integrovaný workflow (nanášení matrixu pomocí SMALDIPrep, AP-SMALDI5 AF, Excedion, MIRION) poskytuje repeatabilní a škálovatelný postup pro vysoce rozlišené MSI projekty.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další optimalizace ion-funnel designu a jeho parametrů pro další snížení in‑source fragmentace a zvýšení přenosu iontů, zejména u malých molekul a lipidů.
• Rozšíření používání kombinovaných MS1/tMS2/ddMS2 režimů pro širší metabolomiku a povrchové farmakokinetické studie v rámci jednoho běhu.
• Využití vysokého prostorového rozlišení (≤5 µm) pro studií buněčné heterogenity, rozpoznání subcelulárních lokalizací a korelaci s histologií (H&E po odstranění matrixu).
• Integrace s pokročilou softwarovou analýzou a databázemi spekter pro rychlejší a automatizované potvrzení struktur sloučenin; možnost zlepšení databázového pokrytí pro nové látky jako zotatifin.
• Možnost kombinace s multimodálními zobrazovacími technikami (imunohistochemie, optické metody) pro komplexnější biologické interpretace.

Závěr

Propojení AP-SMALDI5 AF se spektrometrem Orbitrap Excedion představuje pokrok v MSI umožňující vysoké prostorové rozlišení, citlivé a specifické MS1/MS2 zobrazování s nižší mírou in‑source fragmentace. To zvyšuje spolehlivost lokalizace malých molekul a lipidů v tkáňových sekcích a otevírá cestu pro širší použití ve farmaceutickém výzkumu, parazitologii a biologickém zobrazování na buněčné úrovni.

Reference

1. Spengler B., Römpp A., Guenther S., Schulz O., Hinz K.-P., Hester A.J., Schinz C., Lotze C., Pötzl J.-U., Strupat K., et al. High Resolution in Mass and Space: AP‑MALDI Imaging Technology for Orbitrap‑based Instrumentation. ASMS 2012, Vancouver, Poster ID 241550 TP22436.
2. Vegvari A., Strupat K., Dahlbäck M., Fehniger T., Marko‑Varga G. Muscarinic Receptor Antagonist Target Disposition in Lung Disease Utilizing 10 µm Spatial Resolution of AP SMALDI Tissue Imaging. ASMS 2013, Minneapolis, Poster ID 236007.
3. Spengler B., Römpp A., Schäfer K.C. High Speed AP‑MALDI Imaging at high spatial resolution. ASMS 2013, Minneapolis, Poster ID 264750.
4. Spengler B., Dreisbach D., Schäfer K.-C., Morawietz C.M., Strupat K. MS and MS2 Imaging for compound confirmation: MS, tMS2, ddMS2 approaches for AP‑SMALDI‑MS Imaging with Orbitrap MS. ASMS 2023, Houston, Poster ID 314854.
5. Schäfer K.C., Liebschwager L., Strupat K., Spengler B. Comparison of instrumental synchronization modes in mass spectrometric imaging using Orbitrap mass analyzers. ASMS 2024, Anaheim, Poster ID 320451 TP 206.
6. Thermo Fisher Scientific. Orbitrap Exploris 480 Software Manual, BRE0027667, Revision F, 2024.
7. AP‑SMALDI5 AF Manual for Exploris and Excedion MS platforms, TransMIT, 2023 / 2026.