Advancing spatial lipidomics: high spatial resolution mass spectral imaging (MSI) using the MassTech AP-MALDI UHR ion source with the Orbitrap Exploris mass spectrometer

Pokročilá prostorová lipidomika: AP-MALDI UHR MSI s Orbitrap Exploris pro analýzu RHE

Význam tématu:

Metody snímání rozložení biomolekul přímo v tkáňových řezech (MSI) umožňují lokalizovat lipidy a další malé molekuly bez extrakce a konzervovat morfologii vzorku. V dermatologii je to zásadní — lipidová homeostáza v epidermis ovlivňuje bariérovou funkci, zánětlivé odpovědi a účinnost kosmetických/ochranných přípravků. Kombinace vysoké prostorové rozlišení a vysoké hmotnostní přesnosti otevírá možnost mapovat molekulární změny na úrovni vrstev epidermis (SB, SS, SG, SC) i vliv expozice UV a ochranných formulací na konkrétní lipidové signály.

Cíle a přehled studie / článku:

Cílem bylo předvést schopnosti spojení atmosférického AP-MALDI UHR zdroje (MassTech) s Orbitrap Exploris hmotovým analyzátorem pro vysoké prostorové rozlišení MSI (až 5 µm krok). Studie demonstruje lokalizaci a anotaci lipidů v rekonstruované lidské epidermis (RHE) vystavené simulovanému slunečnímu záření (SSR), včetně porovnání vzorků bez expozice, po UV expozici a po aplikaci ochranného (sun‑filter) přípravku.

Použitá metodika a instrumentace:

Metodika (shrnutí):

• Model: in vitro rekonstruovaná lidská epidermis (RHE, SkinEthic / EpiSkin).
• Příprava: embedding v kombinaci 10 % želatiny a 2,5 % CMC, zmrazení v 2‑metylbutanu, řezání v Cryo‑ultramicrotomu na 6 µm řezy, montáž na APTES potažený nerez podklad, oplach studenou destilovanou vodou.
• Matrix: aplikováno 24 vrstev buď HCCA (α‑cyano‑4‑hydroxycinnamová kyselina) nebo 1,5‑diamino‑naftalen (DAN) v acetonitril/H2O 1:1 + 0,2 % TFA; aplikace pomocí SunCollect MALDI‑sprayeru (flow 15 µL/min, rychlost 600 mm/min).
• MSI akvizice: AP‑MALDI UHR (MassTech) v Constant Speed Raster modu; krok 5 µm; laser 400 Hz při ~3 % energie; m/z 205–2000; injekční čas iontů 490 ms; rozlišení Orbitrap 240 000 při m/z 200; AGC deaktivováno pro konstantní injekční čas; data v pozitivním i negativním režimu; EASY‑IC použit jako in‑spectrum lock mass.
• Úprava vzorků: RHE exponovány simulovaným slunečním zářením (SSR) 16,5 J/cm2 (2× MED); některé preparáty ošetřeny sun‑filter formulací před exponováním; inkubace 24 h před embedováním.
• Datová analýza: konverze surových dat do imzML (MassTech imzML converter), vizualizace a anotace v LipostarMSI (Mass Analytica) s normalizací na TIC a porovnáním s LipidMaps databází.

Použitá instrumentace (výčet):

• MassTech AP‑MALDI UHR ion source (umožňuje přepnutí mezi ESI a MALDI konfigurací za <2 minuty).
• Thermo Scientific Orbitrap Exploris 480 (Orbitrap technologie, EASY‑IC pro lock mass).
• SunCollect MALDI‑Sprayer (SunChrom) pro rovnoměrné nanášení matrixu.
• Cryo‑Ultramicrotome Leica EM FC6 pro přípravu tenkých řezů.
• Softwarové nástroje: MassTech imzML converter, LipostarMSI (v.2.1.0b1) pro vizualizaci, segmentaci a anotaci lipidy podle LipidMaps.

Hlavní výsledky a diskuse:

• Segmentace MSI dat pomocí clusteringu umožnila vymezit struktury RHE odpovídající SB, SS, SG, rozhraní SS/SG, SC a podpůrné polykarbonátové membráně (PCM). Segmenty korespondovaly s histologickými vrstvami modelu.
• Bylo detekováno a lokalizováno sedm hlavních kategorií lipidů: glycerolipidy, steroly (včetně sulfatovaných derivátů), mastné kyseliny, glycerofosfolipidy a sfingolipidy (PC, SM, Cer atd.).
• Vysoké hmotnostní rozlišení a přesnost Orbitrapu (<1 ppm, v příkladu 25‑hydroxy‑cholesterol 3‑sulfát anotován s 0,6 ppm) umožnily spolehlivou molekulární identifikaci přímo v řezu.
• Konkrétní biologický poznatek: signál 25‑hydroxy‑cholesterol 3‑sulfátu (m/z ~481.2993 [M‑H]‑) byl minimální na rozhraní SS/SG v neexponovaných vzorcích, významně zvýšený po UV expozici (lokalizace zejména v SB a SS; p = 0,00028) a při aplikaci ochranného sun‑filteru po expozici se intenzita a distribuce vrátila k úrovním podobným neexponovaným vzorkům. To indikuje, že formulace zabránila UV‑indukovanému nárůstu tohoto zánětlivého/metabolického markeru.
• Prakticky se ukázalo, že kombinace AP‑MALDI UHR a Orbitrap Exploris poskytuje citlivost blízkou vakuovým MALDI systémům, přičemž eliminuje potřebu pump‑down a zjednodušuje práci s hydratovanými nebo volatilisními matricemi.

Přínosy a praktické využití metody:

• Možnost rychlého přepnutí mezi LC‑MS/MS (ESI) a vysokorozlišovací MSI (MALDI) na tomtéž přístroji zvyšuje experimentální flexibilitu a umožňuje korelaci prostorových dat s hlubší strukturální/kvantitativní LC výsledky.
• Vysoké prostorové a hmotnostní rozlišení jsou zvláště užitečné pro analýzu malých, kompaktních vzorků jako jsou in vitro RHE modely, kde je důležité mapovat molekuly napříč vrstvami o šířce desítek až stovek mikrometrů.
• Metoda nabízí přímé aplikace v dermatologickém výzkumu: studium lipidových biomarkerů zánětu, hodnocení účinku UV a ochranných prostředků, vývoj a ověřování kosmetických/průmyslových formulací.

Budoucí trendy a možnosti využití:

• Dále zlepšení rychlosti akvizice a integrace s multi‑omics (např. korelace MSI s proteomikou či transcriptomikou) pro komplexní prostorové mapy buněčných stavů.
• Rozšíření metodiky pro automatizované workflowy a validaci biomarkerů pro průmyslové aplikace (QA/QC v kosmetickém vývoji, screening formulací).
• Využití pokročilých algoritmů pro segmentaci, kolokalizaci a interpretaci dat (strojové učení) pro citlivější detekci regionálně omezených změn.
• Optimalizace preparativních protokolů a matric pro zlepšení ionizace specifických lipidových tříd a snížení matrix‑efektů v komplexních vzorcích.

Závěr:

Spojení AP‑MALDI UHR zdroje s Orbitrap Exploris poskytuje vysoce citlivé, přesné a prostorově detailní snímání lipidomiky přímo v řezech rekonstruované epidermis. Metoda umožnila lokalizaci UV‑indukovaných lipidových změn a ověření ochranného efektu sun‑filter formulace na molekulární úrovni. Díky možnosti rychlého přepnutí mezi ESI a MALDI režimy se jedná o univerzální nástroj vhodný pro výzkum i vývoj v dermatologii a osobní péči.

Reference:

1. Buchberger AR, DeLaney K, Johnson J, Li L. Mass spectrometry imaging: a review of emerging advancements and future insights. Anal Chem. 2018, 90, 240–265.
2. Miyamoto S, et al. Mass spectrometry imaging reveals elevated glomerular ATP/AMP in diabetes/obesity and identifies sphingomyelin as a possible mediator. eBioMedicine 2016, 7, 121–134.
3. Müller MA, Kompauer M, Strupat K, Heiles S, Spengler B. Implementation of a high‑repetition‑rate laser in an AP‑SMALDI MSI system for enhanced measurement performance. J Am Soc Mass Spectrom. 2021, 32, 465–472.
4. Bednařík A, Machálková M, Moskovets E, et al. MALDI MS imaging at acquisition rates exceeding 100 pixels per second. J Am Soc Mass Spectrom. 2019, 30, 289–298.
5. Schneider BB, Lock C, Covey TR. AP and vacuum MALDI on a QqLIT instrument. J Am Soc Mass Spectrom. 2005, 16, 176–182.
6. Dreisbach D, et al. Spatial multi‑omics at the cellular level by AP‑SMALDI MS imaging. Thermo Scientific Application Note AN001550. 2023.
7. Spengler B, et al. High resolution in mass and space: AP‑SMALDI coupled with Orbitrap Exploris mass spectrometer for MS imaging. Thermo Scientific Technical Note TN000659.
8. Angerer TB, Bour J, Biagi JL, Moskovets E, Frache G. Evaluation of 6 MALDI matrices for 10 µm lipid imaging and on‑tissue MSn with AP‑MALDI‑Orbitrap. J Am Soc Mass Spectrom. 2022, 33(5), 760–771.
9. Capolupo L, et al. Sphingolipids control dermal fibroblast heterogeneity. Science 2022, 376.
10. Siciliano AM, Moro F, De Simone G, et al. Mapping small metabolite changes after traumatic brain injury using AP‑MALDI MSI. Anal Bioanal Chem. 2024, 416, 4941–4949.
11. De Macedo CS, Anderson DM, Pascarelli BM, et al. MALDI imaging reveals lipid changes in the skin of leprosy patients before and after multidrug therapy. J Mass Spectrom. 2015, 50, 1374–1385.
12. Ellis SR, Paine MRL, Eijkel GB, et al. Automated, parallel mass spectrometry imaging and structural identification of lipids. Nat Methods. 2018, 15, 515–518.
13. Hart PJ, Francese S, Claude E, Woodroofe MN, Clench MR. MALDI‑MS imaging of lipids in ex vivo human skin. Anal Bioanal Chem. 2011, 401, 115–125.
14. Hochart G, Bonnel D, Stauber J, Stamatas GN. Biomarker mapping on skin tape strips using MALDI mass spectrometry imaging. J Am Soc Mass Spectrom. 2019, 30, 2082–2091.
15. Harvey A, Cole LM, Day R, et al. MALDI‑MSI for the analysis of a 3D tissue‑engineered psoriatic skin model. Proteomics. 2016, 16, 1718–1725.
16. Mitchell CA, Long H, Donaldson M, Francese S, Clench MR. Lipid changes within the epidermis of living skin equivalents observed across a time‑course by MALDI‑MS imaging. Lipids Health Dis. 2015, 14, 1–12.
17. Francese S, Bradshaw R, Flinders B, et al. Curcumin: A multipurpose matrix for MALDI mass spectrometry imaging applications. Anal Chem. 2013, 85, 5240–5248.
18. Feucherolles M, Le W, Bour J, et al. A comprehensive comparison of tissue processing methods for high‑quality MALDI imaging of lipids in reconstructed human epidermis. J Am Soc Mass Spectrom. 2023, 24, 2469–2480.
19. Schramm T, et al. imzML--a common data format for the flexible exchange and processing of mass spectrometry imaging data. J Proteomics. 2012, 75(16), 5106–5110.
20. Nicol NH. Anatomy and physiology of the skin. Dermatol Nurs. 2005, 17, 62.
21. Pasparakis M, Haase I, Nestle FO. Mechanisms regulating skin immunity and inflammation. Nat Rev Immunol. 2014, 14, 289–301.