Comparison of standard vs high-field Orbitrap mass analyzer for charge detection mass spectrometry applications

Význam tématu

Charge detection mass spectrometry (CDMS) rozšiřuje možnosti hmotnostní spektrometrie tím, že přímo měří náboj jednotlivých iontů z jejich obrazového proudu, což umožňuje analyzovat heterogenní vysoce hmotné komplexy, kde konvenční rozlišení stavů nabití selhává. Porovnání standardního a high-field Orbitrap analyzátoru je důležité proto, že design analyzátoru (průměr, elektrické pole, kapacitance a pumping) zásadně ovlivňuje frekvenční rozlišení, poměr signálu k šumu, dobu přežití iontů a tedy dosažitelnou přesnost hmotnosti a náboje v CDMS a v Direct Mass Technology (DMT) režimu. To má přímý význam pro aplikace v natívní a top-down proteomice, kvalitativní a kvantitativní analýzu bioterapeutik a studium velkých biomolekulárních komplexů.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo systematicky porovnat výkonnost standardního (označovaného D30) a high-field (D20) Orbitrap analyzátoru pro CDMS/DMT aplikace na natívních i denaturovaných proteinech. Studie zkoumá rozdíly v dosaženém m/z rozlišení, šumu, přežití iontů při dlouhých transientech (až 4 s), přesnosti určení náboje a schopnosti detekovat vysokohmotnostní fragmenty v top-down experimentech. Data byla získána především ve formě dlouhých transiéntů a zpracována metodami STORI/misSTORI a Fourierovou transformací.

Použitá metodika

• Vzorky: monoklonální protilátka Adalimumab (Humira), β-galaktosidáza (BG) v natívním prostředí (50 mM NH4OAc), bovinní karboanhydráza II (CA) denaturovaná v H2O:ACN:MeOH (2:1:1) s 0,1 % kys. mravenčí.
• Ionizace: přímá infuze se statickým nanoESI; průtok pro denaturovanou CA 5 µL/min.
• Synchronizace sběru: transiénty až do 4 s z interního akvizičního systému.
• Zpracování dat: offline zpracování surových transiéntů pomocí misSTORI a Fourierovy transformace; pro CA MS2 .RAW použity STORIboard a ProSight Native TDValidator.

Použitá instrumentace

• Standardní analyzátor: Thermo Scientific Q Exactive UHMR (QE-UHMR) s D30 (standard) Orbitrap analyzátorem.
• High-field analyzátory: modifikovaný Orbitrap Exploris 480 (OE480) a modifikovaný Orbitrap Tribrid, oba s D20 (high-field) Orbitrap analyzátorem.
• Klíčové rozdíly mezi D30 a D20: průměr 30 mm vs 20 mm; jednostranné vs dvoustranné pumping; pastní napětí 5 kV vs 4 kV; nominální FT rozlišení při 200 m/z a 1 s transiéntu ~280 000 (D30) vs ~480 000 (D20).

Hlavní výsledky a diskuse

• m/z rozlišení: high-field (D20) poskytuje téměř 1,7násobné zvýšení FT rozlišení při stejném čase transiéntu díky silnějšímu elektrickému poli (vyšší oscilační frekvence iontů pro dané m/z).
• Šum a poměr signál/šum: snížená kapacitance D20 vede k ~1,4× nižšímu šumu v porovnávaném m/z pásmu, což umožňuje dosáhnout stejného S/N při zhruba poloviční délce transiéntu oproti D30. Toto je zvláště důležité pro single-ion CDMS, kde je šum limitujícím faktorem pro přesnost určení náboje.
• Přežití iontů při dlouhých transiéntech: při 4 s transiéntu přežilo kontinuální STORI segmentování 32 % iontů na high-field (OE480) oproti 13 % na standardním QE-UHMR. Hlavními faktory jsou lepší ultra vysoké vakuum (7.4×10^-11 vs 1.3×10^-10 mbar) a dvoustranné pumping u D20, které snižují kolizní dekay.
• Centroiding vs FT rozlišení: pro denaturovanou CA (29 kDa, z≈33) bylo v ensemble FT režimu zapotřebí ~1 s na D30 a ~0,5 s na D20 pro baseline rozlišení hlavního izotopického obrysu. V single-ion režimu však rozhoduje centroding přesnost; jednotlivé centroidy z oddělených skenů dovolují získat baseline rozlišenou izotopickou distribuci při zlomku transiéntu požadovaného pro ensemble FT.
• Top-down: DMT (single-ion) režim na high-field analyzátoru umožnil detekovat větší fragmentní ionty (>20 kDa), kdežto ensemble měření na stejném systému dominovala menší fragmenty do ~12 kDa. DMT tedy doplňuje ensemble přístup a zvyšuje šanci na identifikaci a charakterizaci velkých produktových iontů a proteoform.

Přínosy a praktické využití metody

• Zkrácení potřebného transiéntu: vyšší frekvence a vyšší S/N D20 umožňují kratší akviziční časy bez ztráty informace, což je výhodné pro ionty, které rychle degradují při delších transiéntech (top-down fragmenty, nestabilní vysokomolekulární komplexy).
• Zlepšená přesnost náboje a hmotnosti: lepší charge resolution přímo zvyšuje spolehlivost CDMS při dekonvoluci kongesovaných spekter a při charakterizaci heterogenních vzorků (mAb, proteoformy, velké komplexy).
• Praktické aplikace: analýza bioterapeutik (kvalita, proteoformy), studie virových částic, adeno-asociovaných vektorů, natívní proteomika a top-down proteomika s rozšířeným dosahem pro vysokomasové produktové ionty.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další optimalizace analyzátorů: snížení kapacitance, lepší pumping a optimalizace elektrických polí pro ještě vyšší S/N a rozlišení při kratších transiéntech.
• Integrace CDMS/DMT do standardních top-down workflowů: automatizace výběru segmentů, kombinace s MS/MS fragmentací a pokročilé softwarové nástroje pro centroiding a validaci produktních iontů.
• Vyšší propustnost: zkrácené doby akvizice a lepší ion survival umožní přenést CDMS z primárně výzkumných aplikací do rutinní QC analýzy v biotechnologii.
• Rozšíření aplikací: cílené studie proteoformů, kvantifikace nízkoabundantních variant, analýza částic pro genovou terapii a studium makromolekulárních agregátů ve farmaceutické výrobě.

Závěr

Shrnutí ukazuje, že high-field Orbitrap (D20) přináší významné výhody pro CDMS/DMT: vyšší FT rozlišení, nižší šum, lepší přežití iontů při dlouhých transiéntech a možnost spolehlivěji určovat náboj a hmotnost i při kratších akvizičních časech. Tyto vlastnosti zvláště podporují nasazení DMT režimu v top-down proteomice, kde zlepšená detekce velkých fragmentů a vysoká centroiding přesnost doplňují tradiční ensemble přístupy. Pro praxi to znamená lepší charakterizaci proteoform a vyšší šance na detekci nízkoabundantních, vysoce hmotnostních druhů v biologických i biotechnologických aplikacích.

Reference

1. Wörner TP, Grinfeld D, Makarov AA. Comparison of standard vs high-field Orbitrap mass analyzer for charge detection mass spectrometry applications. Thermo Fisher Scientific; 2026. PO004726-2026-EN.