Screening To Quantitation: DDA Of Extractables To Determine Markers Of Interest For Quantitation Using Tof MRM With A Multi-Reflecting Time-of-Flight Mass Spectrometer

Význam tématu

Screening a kvantifikace extractables a leachables (E&L) z polymerních obalových systémů a zdravotnických zařízení jsou klíčové pro zajištění bezpečnosti léčiv a medicínských produktů. Schopnost rychle identifikovat potenciálně rizikové složky a následně je přesně kvantifikovat při nízkých koncentracích umožňuje plnit regulatorní limity a minimalizovat riziko expozice pacientů. Kombinace datově závisného získávání (DDA) pro selekci markerů a vysoce citlivého cíleného režimu Tof MRM na multireflektivním TOF přístroji představuje efektivní workflow pro přechod od screeningové identifikace k kvantitativní analýze.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo demonstrovat pracovní postup, kdy se DDA používá k selekci diagnostických fragmentů z komplexní směsi typických extractables (SST mix) a následně tyto fragmenty využívají pro optimalizované kvantitativní měření metodou Tof MRM na zařízení Xevo MRT. Práce zahrnovala porovnání DDA a DIA režimů, výběr specifických fragmentních iontů pro MRM přechody, optimalizaci Tof MRM metody a kvantifikaci spikovaných sloučenin v matici ze zkušebního nosního aplikačního systému.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Screening: Data-dependent acquisition (DDA) pro zjištění fragmentačních iontů. Survey skeny prováděny při 10/20 Hz v rozsahu m/z 50–1200. MS/MS skeny při 20/50 Hz, „top 10“ iontů vybraných pro MS/MS.
• Triggering: přechod ze survey do MS/MS při intenzitě >20000 cps; návrat při intenzitě <10000 cps nebo po 3 s timeoutu. Kolizní energie: ramp 10–75 V napříč celým m/z rozsahem (v některých nastaveních udáváno Low 6 eV; High 20–60 eV).
• Porovnání: DDA vs DIA – vyhodnocení specificity MS/MS spekter a počtu neatributovaných fragmentních píků.
• Cílená kvantifikace: Tof MRM s Enhanced Duty Cycle (EDC) pro vysoké využití iontů a zvýšenou citlivost.

Použitá chromatografie (ACQUITY Premier):

• Kolona: ACQUITY CORTECS C18, 1.6 µm, 2.1 x 100 mm, 90 Å.
• Mobilní fáze: A = voda + 1 mM amonný acetát + 0,1 % kyseliny mravenčí; B = methanol.
• Průtok: 0.3 mL/min; teplota kolony: 50 °C; objem injekce: 1 µL; doba gradientu: 15 min.

Použitá instrumentace (shrnutí):

• Hmotnostní spektrometr: Waters Xevo MRT (multireflecting time-of-flight, MRT).
• UHPLC systém: ACQUITY Premier System (Waters).
• Ionizace: ESI+, napětí přibližně 2.5 kV; zdroj/odsolnovací teploty: 120/550 °C; plyny: desolvace 800 L/hr, cone 50 L/hr.
• Softwarové zpracování: waters_connect platforma, UNIFI Application a MS Quan pro zpracování dat a kvantifikaci.

Hlavní výsledky a diskuse

Identifikace a přesnost:

• Všechny složky SST mixu byly detekovány jak v DDA, tak v DIA režimech. RMS hmotnostní přesnost napříč DDA injekcemi a analyty byla ≤1 ppm, což potvrzuje vysokou přesnost určení m/z hodnot pro selekci přechodů.

Specifičnost MS/MS:

• DDA významně redukovalo počet fragmentních píků, které nebyly atribuovány k prekurzoru, ve srovnání s DIA. Pro příklad Cyasorb 2908 při retenční době 9,08 min došlo k poklesu počtu neatributovaných píků o ~33 % v DDA spektru (standard) a o ~48 % v DDA spektru vzorku v matrici.
• Tato redukce vedla k čistším, více diagnostickým MS/MS spektrům, usnadňujícím výběr specifických fragmentů pro MRM přechody.

Optimalizace Tof MRM a citlivost:

• Selected fragmenty z DDA spekter byly použité pro vytvoření Tof MRM přechodů. EDC režim umožňuje synchronizované zachytávání a uvolňování cílových iontů s pusherem, čímž se blíží téměř 100% využití iontů v daném m/z rozsahu a výrazně se zvyšuje citlivost metody.
• Kalibrační křivka pro Cyasorb 2908 vykázala linearitu od 0.01 ng/mL (S/N 17) do 100 ng/mL s R2 = 0.9947. Měřená koncentrace ve spikovaném nosním roztoku byla 9.39 ng/mL vs očekávaných 10 ng/mL, tedy přijatelná odchylka v rámci analytické přesnosti.
• S/N hodnoty i v nejnižší úrovni (0.01 ng/mL) ukazují schopnost metody detekovat velmi nízké koncentrace relevantní pro E&L screening.

Celkové zhodnocení:

• Workflow DDA → kurátorské vybrání fragmentů → Tof MRM poskytuje synergii mezi vysokou selektivitou (DDA) a vysokou citlivostí (Tof MRM/EDC).
• Porovnání s DIA potvrzuje, že DDA je výhodné pro selekci čistých, analyticky použitelných fragmentů, obzvláště v komplexních matricích, kde DIA může generovat více neatribuovaných fragmentů, které komplikují výběr vhodných MRM přechodů.

Přínosy a praktické využití metody

• Umožňuje rychlý přechod od neřízeného screeningu k cílené kvantifikaci bez nutnosti samostatného dlouhého vývoje metodiky pro přechody — DDA generuje „library“ fragmentů vhodných pro kvantitativní přechody.
• Vysoká citlivost a nízké LLOQ umožňují splnění přísných screeningových limitů vyžadovaných v regulaci farmaceutických obalů a medicínských zařízení.
• Metoda je použitelná pro potvrzovací analýzy v QA/QC laboratořích, při hodnocení rizik materiálů a při testování finálních výrobků nebo výluhů z materiálů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další rozvoj automatizace výběru fragmentů z DDA spekter a tvorby přechodových sad (přímé napojení DDA výsledků do šablon Tof MRM) zrychlí adopci workflow v průmyslových laboratořích.
• Rozšiřování knihoven fragmentů pro typické polymerní additivy a stabilizátory umožní rychlejší a spolehlivější identifikaci známých rizikových látek.
• Integrace s pokročilými datovými platformami a machine learning pro zvyšování jistoty identifikací a prediktivní výběr markerů pro kvantifikaci.
• Rozšíření aplikací na další matrice (biologické tekutiny, komplexní farmaceutické systémy) a validace metod v souladu s regulačními požadavky pro kvantitativní analýzy E&L.

Závěr

Studie ukazuje efektivní a praktický přístup kombinující DDA pro kvalitativní selekci markerů a Tof MRM v režimu EDC pro cílenou kvantifikaci. Tento přístup přináší lepší selektivitu MS/MS spekter, vyšší citlivost při kvantifikaci a možnost detekce velmi nízkých koncentrací relevantních pro bezpečnostní hodnocení obalových materiálů a zdravotnických zařízení. Workflow je vhodný pro implementaci v analytických laboratořích zaměřených na E&L screening a podporuje splnění regulatorních požadavků.

Reference

1. USP-NF/PF, <1664> Assessment of Drug Product Leachables Associated with Pharmaceutical Packaging/Delivery Systems.
2. ISO 10993-18:2020 Biological evaluation of medical devices — Part 18: Chemical characterization of medical device materials within a risk management process.
3. Stevens D., Cabovska B., Bailey A. Detection and Identification of Extractable Compounds from Polymers. Waters Application Note 720004211. January 2012.
4. Sanig R., Kirk J., Gethings L., Lock R. Increased Identification Confidence for Extractables Screening Using the Xevo MRT Mass Spectrometer. Waters Application Note 720008970. August 2025.
5. Daly M., Gethings L., Hughes C., Lock R., Syed N. Tof MRM for the Quantification of Peptide Biomarkers in Human Glioblastoma with the Xevo MRT Mass Spectrometer. Waters Application Note 720008972, October 2025.