Comprehensive extractables and leachables characterization through an integrated single injection Quan/Qual analysis using a benchtop multi-reflecting time-of-flight mass spectrometer

Význam tématu

Analýza extractables a leachables (E&L) je kritická pro bezpečnost léčivých přípravků a zdravotnických prostředků, protože odhaluje chemické látky uvolňované z obalových materiálů nebo komponent. Přesná identifikace a kvantifikace sloučenin nad hodnotou pro toxikologické hodnocení a současné sledování stopových leachables ve finálních formulacích je nezbytná pro splnění regulačních požadavků a minimalizaci rizik pro pacienta.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo předvést integrovaný postup, který v jediné chromatografické injekci kombinuje kvantitativní cílenou analýzu a nekonvenční screening pro identifikaci neznámých E&L. Autoři ukazují, že benchtop multi-reflecting time-of-flight (MRT) hmotnostní spektrometr může současně běžet v režimu Tof MRM pro citlivou kvantifikaci a v režimu MSE (DIA) pro získání prekurzorových i fragmentačních dat pro identifikaci a retrospektivní prověrku.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika kombinovala chromatografii UHPLC s paralelní akvizicí dvou režimů hmotové spektrometrie v jedné injekci. Hlavní aspekty:

• Kapalinová chromatografie: ACQUITY Premier System se sloupcem ACQUITY CORTECS C18 (90 Å, 1.6 µm, 2.1 x 100 mm), průtok 0.3 mL/min, teplota kolony 50 °C, gradient 15 min, injekční objem 1 µL. Mobilní fáze: voda s 1 mM amonného acetátu a 0.1 % kyseliny mravenčí (A) a methanol (B).
• Hmotová spektrometrie: Xevo MRT P10 (MRT MS) se zakódovanou akvizicí m/z 50–1200. MSE skenovací rychlost 10 Hz; Tof MRM s optimalizovaným dwell časem; zdroj ESI v pozitivním/negativním módu (ESI+ 2.5 kV, ESI- 1.5 kV); desolvace 550 °C; průtoky plynů 800/50 L/hr. Kollizní energie: nízká 6 eV, vysoká 20–60 eV.
• Režimy akvizice: Tof MRM využívá Enhanced Duty Cycle (EDC) pro téměř 100% využití iontů v cílovém m/z rozsahu a zvyšuje citlivost; MSE střídá nízkou a vysokou kolizní energii pro současné získání prekurzorových a fragmentačních informací.
• Software a správa dat: waters_connect platforma, UNIFI Application a MS Quan pro zpracování dat a kvantifikaci; použití knihovny Waters E&L pro screening identifikací.

Hlavní výsledky a diskuse

Klíčové nálezy a poznatky zahrnují:

• Kombinovaná akvizice umožnila současnou citlivou kvantifikaci známých leachables (Tof MRM) a retrospektivní identifikaci neznámých nebo neočekávaných extractables (MSE) bez nutnosti opakovaných běhů.
• Citlivost: Propylparaben ve negativním ionizačním módu vykázal lineární kalibraci v rozmezí 0.01–100 ng/mL při R2 = 0.99; signál/šum pro nejnižší bod (0.01 ng/mL) byl ~23, což ukazuje na schopnost kvantifikovat sub-ndg/mL hladiny. Průměrná naměřená koncentrace ve vzorcích spike byla 10.04 ng/mL pro očekávaných 10 ng/mL (dobrá přesnost metody).
• Přesnost identifikací: MSE poskytl vysokou přesnost hmotnosti s RMS v oblasti nízkých až sub-ppm, což výrazně zužuje počet možných struktur. Jako příklad byla protonovaná iontová stopa m/z 338.3417 přiřazena k erucamidu s chybou 0.94 ppm; fragment 321.3152 měl chybu 0.34 ppm.
• Porovnání citlivosti: Extracted ion chromatogramy z MSE vykazovaly nižší signál než optimalizované MRM přechody pořízené současně v téže injekci — ukázka zvýšené citlivosti Tof MRM.
• Matice: Spiking do komplexní matrice (nosní sprej) demonstrovalo použitelnost přístupu i v přítomnosti matrice formulace; při přítomnosti signálu v blanku byla použita metoda standard addition pro korekci pozadí (příklad Irganox 1076 konfirmace ~10.7 ng/mL odhadované vs 10 ng/mL skutečně přidaných).

Přínosy a praktické využití metody

Metoda přináší několik praktických výhod:

• Snížení laboratorního workflow: eliminace nutnosti separátních běhů pro kvantifikaci a screening šetří čas a spotřebu vzorku.
• Vysoká citlivost a přesnost identifikací umožňují splnění regulačních požadavků na detekci/leachables na úrovních relevantních pro toxikologii.
• Retrospektivní analýza získaných MSE dat umožňuje dodatečné vyhledávání neznámých komponent bez opakované analýzy vzorků.
• Platforma je vhodná jak pro screening polymerů a obalů, tak pro analýzu finálních produktů s ohledem na rizikové hodnocení.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možnosti dalšího rozvoje a uplatnění zahrnují:

• Rozšíření knihoven a databází E&L pro zrychlení a zlepšení důvěryhodnosti přiřazení neznámých signálů.
• Automatizace workflow a integrace s nástroji pro řízení kvality a toxikologické hodnocení pro rychlejší rozhodování v regulovaném prostředí.
• Využití pokročilých algoritmů (strojové učení) pro podporu identifikace fragmentačních vzorů a predikci struktur u nekompletně popsaných látek.
• Další zvyšování citlivosti a propustnosti (throughput) pro nasazení v rutinním QA/QC v průmyslových podmínkách.

Závěr

Studie demonstruje technicky proveditelný a efektivní přístup ke komplexnímu E&L screeningu kombinací Tof MRM a MSE v jediné injekci na MRT platformě. Tento integrovaný postup přináší výrazné výhody v citlivosti, identifikační důvěryhodnosti a provozní efektivitě, čímž řeší běžné úzké hrdlo v E&L workflow a podporuje splnění regulačních požadavků.

Reference

1. USP-NF/PF, <1664> Assessment of Drug Product Leachables Associated with Pharmaceutical Packaging/Delivery Systems.
2. ISO 10993-18:2020 Biological evaluation of medical devices — Part 18: Chemical characterization of medical device materials within a risk management process.
3. Sanig R., Kirk J., Gethings L., Lock R. Increased Identification Confidence for Extractables Screening Using the Xevo MRT Mass Spectrometer. Waters Application Note 720008970. August 2025.
4. Daly M., Gethings L., Hughes C., Lock R., Syed N. Tof MRM for the Quantification of Peptide Biomarkers in Human Glioblastoma with the Xevo MRT Mass Spectrometer. Waters Application Note 720008972, October 2025.
5. Stevens D., Cabovska B., Bailey A. Detection and Identification of Extractable Compounds from Polymers. Waters Application Note 720004211. January 2012.