Enabling Deep Proteome Coverage at Ultra- High-Throughput Using Stepped-quadrupole DIA (SONAR Pulse) on the Xevo™ MRT P10 Benchtop Multi-reflecting TOF Mass Spectrometer

Význam tématu

Rychlá, opakovatelná a hloubková proteomická analýza je klíčová pro rozsáhlé biologické studie, klinické kohorty a rutinní QA/QC aplikace. Tradiční data-independent acquisition (DIA) metody čelí kompromisu mezi hloubkou pokrytí proteomu, analytickou propustností (throughput) a specifitou prekurzorů při zkrácených chromatografických gradientech. Prezentovaná metoda SONAR Pulse na platformě Xevo MRT P10 ukazuje, že kombinace velmi rychlého MS/MS sběru, vysoké duty cycle a sekvenčně krokovaných (stepped) úzkých kvartupólových oken dovoluje udržet vysokou hloubku proteomu i při ultra‑vysokém throughputu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo demonstrovat workflow pro ultra‑vysokorychlostní DIA založené na SONAR Pulse (stepped‑quadrupole DIA) na benchtop víceodrazovém TOFXevo MRT P10 a ověřit, že lze při krátkých LC gradientech zachovat informacemi bohatá MS/MS spektra, dobrou selektivitu prekurzorů a kvantitativní robustnost. Jako modelová matrice byl použit K562 lidský tryptický digest a výkonnost byla hodnocena přes rozsah gradientů a zatížení vzorku.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky a separace:

• K562 lidský buněčný lysát, tryptický digest (komplexní a dobře charakterizovaný proteomový standard).
• Krátké vysokopropustné separace: Evosep Eno (metody 60 samples-per-day a rychlejší).
• Delší separace: ACQUITY UPLC M‑Class (pro srovnání 8–24 SPD ekvivalentně).

Hmotnostní spektrometrie a akvizice:

• Xevo MRT P10 Benchtop Multi‑reflecting TOF Mass Spectrometer v režimu SONAR Pulse (stepped‑quadrupole DIA).
• Příklad metody: MS1 survey 50 ms (m/z 400–900), poté ~100 MS/MS skenů získaných při 100 Hz; kvartupólové izolační okno 5 Da krokově přes 400–900 m/z; MS2 rozsah detekce TOF 50–1200 m/z; celkový cycle time ~1,05 s.
• Technická vylepšení: minimalizace interscan zpoždění a synchronizace výstupu iontů z gas cell s pusherem TOF (wideband EDC) pro maximalizaci iontové využitelnosti a zvýšení MS/MS citlivosti i při >100 Hz.

Zpracování dat:

• Automatické převody RAW → mzML pomocí waters_connect.
• Vyhledávání a kvantifikace v DIA‑NN2 se spektrovou knihovnou (library search), fixní modifikace karbamidomethylace C, variabilně oxidace M, FDR 1 %; ostatní parametry výchozí.

Hlavní výsledky a diskuse

Principu SONAR Pulse je, že mnoho úzkých izolačních oken krokově pokrývá rozsah prekurzorů během jediného ~1s cyklu, čímž kombinuje dobrou selektivitu prekurzorů s dostatečným pokrytím chromatografických vrcholů i při krátkých gradientech. Klíčové nálezy:

• MS/MS citlivost byla zachována při velmi vysokých frekvencích (>100 Hz) díky optimalizované synchronizaci a redukci ztrát mezi skeny. To umožňuje získávat informačně bohatá spektra i při velmi krátkých akvizičních časech.
• Rozlišovací schopnost a přesnost hmotnosti zůstávají na vysoké úrovni i při vysokých rychlostech (uvedeno až ~100 000 FWHM), což zvyšuje jistotu při přiřazování fragment‑iontů a snižuje vliv interferencí v komplexních DIA spektrách.
• Proteomická hloubka škáluje s délkou chromatografie a množstvím naloženého materiálu: pro 500 ng naložení bylo dosaženo přibližně 4 500 identifikací při extrémně vysokém throughputu (500 SPD) až po ~9 000 identifikací při nejdelších testovaných separacích (12 SPD). Při 50 ng naložení byly hodnoty přibližně 3 200 (500 SPD) až ~8 000 (12 SPD). To demonstruje zachování coverage i v režimu skutečně vysokého průtoku.
• Spektrální kvalita se při porovnání nižších a vyšších MS2 rychlostí (např. 50 vs. 200 Hz) významně nezhoršila; počet vzorků na chromatografický vrchol zůstal adekvátní pro kvantifikaci.

Diskuse upozorňuje, že hlavním úzkým místem v high‑throughput DIA je citlivost MS/MS při krátkých akvizičních časů; technické vylepšení MRT P10 (duty cycle, wideband EDC) adresují právě tento problém a dovolují používat více a užších oken bez ztráty kvality dat.

Přínosy a praktické využití metody

• Umožňuje výrazně zvýšit analytickou propustnost bez zásadní ztráty hloubky proteomu — vhodné pro velké kohortní studie, screeningy a rutinní provoz.
• Zlepšená selektivita izolace s úzkými 5 Da okny snižuje interferenci signálů a zvyšuje kvalitu kvantifikace v komplexních matricích.
• Vysoké rozlišení a přesnost hmotnosti při rychlém sběru podporují spolehlivou identifikaci a robustní kvantifikaci, což je důležité pro biomarkerové studie, farmaceutický vývoj a klinické aplikace.
• Workflow je škálovatelný podle doby chromatografie a zatížení vzorku — laboratorní provozy mohou upravovat rovnováhu mezi rychlostí a hloubkou podle experimentálních požadavků.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Dále rozvíjené algoritmy (AI/ML) pro dekonvoluci a library‑free analýzu mohou umožnit ještě lepší využití informací z rychlých SONAR Pulse dat bez závislosti na rozsáhlých spektrálních knihovnách.
• Integrace reálného času QC, automatizovaného vyhodnocení dat a adaptivních akvizičních strategií by mohla zvýšit efektivitu provozu v klinických a průmyslových laboratořích.
• Možné rozšíření do aplikací s velmi nízkým množstvím materiálu (směrem k single‑cell proteomice) závisí na dalším zlepšení citlivosti a minimalizaci ztrát při přípravě vzorků.
• Širší adopce v rutinních vyšetřeních a velkých kohezích bude záviset na dostupnosti přístrojů, zjednodušení workflow a dalším snížení nákladů na analýzu na vzorek.

Závěr

SONAR Pulse na Xevo MRT P10 představuje technický přístup, který zmírňuje tradiční kompromisy mezi hloubkou proteomu a throughputem v DIA experimentech. Díky vysoké MS/MS rychlosti, vylepšenému duty cycle a úzkým krokovaným kvartupólovým oknům lze na krátkých gradientech dosáhnout informacemi bohatých spekter, dobré selektivity prekurzorů a robustní kvantifikace. Předložená data na K562 digestech potvrzují škálovatelnost a praktičnost metody pro vysoce propustné proteomické analýzy.

Použitá instrumentace

• Xevo MRT P10 Benchtop Multi‑reflecting TOF Mass Spectrometer (Waters) – SONAR Pulse režim, stepped‑quadrupole DIA.
• Evosep Eno – vysokopropustné krátké gradienty (např. 60 SPD a rychlejší).
• ACQUITY UPLC M‑Class System (Waters) – delší separace pro porovnání (12SPD a podobně).
• Software: waters_connect pro konverzi do mzML; DIA‑NN2 pro vyhledávání a kvantifikaci.

Reference

1. Demichev V, Messner CB, Vernardis SI, Lilley KS, Ralser M. DIA‑NN: neural networks and interference correction enable deep proteome coverage in high throughput. Nat Methods. 2020 Jan;17(1):41‑44. doi:10.1038/s41592‑019‑0638‑x.
2. Verenchikov AN, Wildgoose J, Kirillov SN, Vorobyev AV, Makarov VV, Gethings LA, Tonge RP, Daly ME, Johnson WJ, Langridge JI. A Novel Compact Multi‑Reflecting Time‑of‑Flight Mass Spectrometer. J Am Soc Mass Spectrom. 2026 Mar 4;37(3):601‑611. doi:10.1021/jasms.5c00321.