A Comparative Qualitative and Quantitative Assessment of SONAR for High-Throughput Proteomic Applications

Význam tématu

Proteomické analýzy v dnešní biologii a medicíně čelí neustálému tlaku na vyšší průchodnost vzorků a současně zachování citlivosti a selektivity měření. Zrychlené chromatografické metody i datově nezávislá akvizice (DIA) umožňují zkrácení doby analýzy a spolehlivou detekci proteinů v komplexních směsích. Metoda SONAR představuje novou variantu DIA, která využívá skenovacího kvadrupólu pro zvýšenou selektivitu i při rychlých bězích.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo srovnat kvalitu a kvantitu výsledků získaných akvizicí SONAR a tradičním SWATH režimem na příkladu tryptického digestu K562 buněčné linie. Experimenty proběhly při gradientu 30 a 60 minut na kapilární chromatografii za použití mikroprůtoku a následným zpracováním dat v Mascot Distiller a Spectronaut Pulsar.

Použitá metodika a instrumentace

• Příprava vzorku: komerční tryptický digest K562 (1–10 µg na injekci).
• LC podmínky: ACQUITY UPLC M-Class, NanoEase kolonna 300 µm × 100 mm, 1,8 µm HSS T3 C18, 35 °C, 7 µL/min, gradient 3–40 % B v 30/60 min.
• SWATH akvizice: Sciex TripleTOF 5600, 50–2000 m/z, 60 proměnných oken (60 Da), 1 Da překryv.
• SONAR akvizice: Waters Xevo G2-XS QTof, ESI (+) 3,2 kV, skenovací kvadrupól 400–900 m/z (24 Da okno), 0,5 s na režim, nízká/vysoká srážková energie (5 eV vs. 19–45 eV).
• Informatika: Mascot Distiller, Spectronaut Pulsar, knihovna K562.

Hlavní výsledky a diskuse

Princip SONAR spočívá v lineárním skenování kvadrupólu během nízkoenergetických (MS1) a vysokoenergetických (MS2) cyklů, což vytváří až 200 TOF spekter za běh. Pro zachování kvality kvantifikace bylo zvoleno skenování 0,5 s, což umožňuje získat 6–8 datových bodů na šířku píků ~3 s. Ve srovnání se SWATH metoda SONAR poskytla:

• Vyšší selektivitu fragmentačních iontů s odstraněním interferencí (např. u y3, y4 fragmentů).
• Zvýšení počtu identifikovaných proteinových skupin o ~600 při 30min gradientu a ~300 při 60min gradientu.
• Udržení retenční přesnosti s CV ~2 %.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné navýšení kvality identifikací při zachování krátkých analytických běhů.
• Vhodné pro vysoce průchozí rutinní proteomiku, klinické i průmyslové aplikace.
• Zachování přesné kvantifikace i při vyšší rychlosti měření.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další zkrácení doby skenování a rozšíření m/z rozsahu, integrace s pokročilými nano- a mikroflow systémy, aplikace v klinické proteomice a kvalitativních kontrolách biofarmaceutik. Kombinace SONAR s AI-podporovanou analýzou dat může dále zvýšit výkon a hloubku analýzy.

Závěr

Studie prokázala, že SONAR akvizice přináší významné kvalitativní a kvantitativní výhody oproti SWATH zejména při rychlých LC-MS bězích. Metoda nabízí vyšší selektivitu, více identifikací proteinů a robustní kvantifikaci, čímž se stává ideálním nástrojem pro vysoce průchozí a citlivé proteomické analýzy.

Reference

1. Gethings LA et al. Rapid Commun Mass Spectrom. 2017;31(19):1599–1606.
2. Moseley AM et al. J Proteome Res. 2017; DOI:10.1021/acs.jproteome.7b00464.
3. Bruderer R et al. Proteomics. 2016;16(15-16):2246–2256.