Determination of nitrite and nitrate from lactose by ion chromatography using the NGES-A suppressor

Analýza nitritů a dusičnanů v laktóze pomocí iontové chromatografie se suppressorem NGES-A — shrnutí

Význam tématu

Nitrity a dusičnany v excipientních surovinách představují rostoucí bezpečnostní riziko, protože mohou být prekurzory karcinogenních N-nitrosaminů v přítomnosti sekundárních či terciárních aminů v API nebo během formulace. Spolehlivá kvantifikace stopových koncentrací těchto aniontů je proto klíčová pro hodnocení rizika a shodu s farmakopeálními požadavky. Iontová chromatografie (IC) se suppressorem zůstává praktickou a široce akceptovanou technikou pro současné stanovení NO2- a NO3- díky své selektivitě, citlivosti a schopnosti separace více analytů najednou.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo demonstrovat metodiku IC se suppressorem NGES-A pro stanovení nitritu a dusičnanu v laktóze monohydrátu a v koloidním oxidu křemičitém. Metoda má splnit požadavky USP analytických poznámek: dosáhnout nízkých mezer detekce a kvantifikace, lineárnosti, přesnosti a opakovatelnosti potřebné pro rutinní kontroly kvality excipientů.

Použitá instrumentace

• Dionex Integrion HPIC systém (případně Inuvion IC nebo ICS-6000 HPIC ekvivalenty)
• Eluent generator cartridge: EGC KOH 500
• Detektor: vodivostní detekce s CD (conductivity detector)
• Autosampler: Dionex AS-AP
• Kolony: Dionex IonPac AS19-4µm analytická (4 × 250 mm) a AG19 guard (4 × 50 mm)
• Suppressor: Dionex NGES-A, 4 mm, režim Recycle; proud suppressoru 124 mA
• Další: CR-ATC 600 anion trap, 0.2 µm nylonový filtr (Millex)
• Pro plyny: He nebo N, 4.5 grade

Operační podmínky: průtok 1.0 mL/min, injekční objem 200 µL (full loop), teplota kolony 40 °C, doba běhu 55 min. Eluent: gradient KOH 5 → 50 mM (viz eluentní program), suppressor v režimu recyklace pro snížení šumu a rychlejší stabilizaci baseliny.

Použitá metodika

Vzor: 25 mg/mL vzorek (250 mg vzorku do 10 mL 5 mM KOH jako diluent), sonikace, doplnění do objemu, filtr přes 0.2 µm nylonový filtr. Kalibrační roztoky připraveny z 1000 mg/L standardů ředěním do rozsahu odpovídající 2.5–1000 µg/L (NO2-) a 5–2000 µg/L (NO3-). Stanovení pomocí potlačené vodivostní detekce s vyhodnocením podle poměru odpovědí vzorek/standard upraveného na mg/mL vzorového roztoku. Systém před analýzou kondicionován KOH 50 mM (flushing guard a analytická kolona) a suppressor vyžaduje hydrataci dle instrukcí výrobce.

Hlavní výsledky a diskuse

• Separace: IonPac AS19 poskytl kvalitní oddělení nitritu a dusičnanu od ostatních aniontů v matrici laktózy a koloidního SiO2; rozlišení mezi cílovými piky >1.5, bez významných koelucí.
• Citlivost a LOQ: Na základě poměru signálu k šumu (S/N ≥ 20) byly deklarované praktické kvantifikační úrovně 0.1 µg/g pro nitrit a 0.2 µg/g pro dusičnan (vztaženo k 25 mg/mL vzorku). S/N na LOQ byly 57 (nitrit) a 77 (dusičnan); RSD LOQ replik 1.71% a 0.96%.
• Lineární rozsah a přesnost: Linearity r > 0.999 (nitrit 0.9999, dusičnan 0.9996) v uvedených rozsazích; recoveries při spikech v třech úrovních se pohybovaly u nitritu mezi ~79–109% a u dusičnanu ~97–118%, tedy v rámci přijatelných mezer (u nižší úrovně nižší recovery u dusičnanu, ale průměrné hodnoty jsou přijatelné s ohledem na uvedenou přesnost ±30%).
• Opakovatelnost: %RSD opakovaných injekcí a spike vzorků byly velmi nízké (<2% u většiny měření), což ukazuje na dobrou stabilitu a reprodukovatelnost metody.
• Vliv suppressoru NGES-A: Nový elektrolytický suppressor vykázal nižší šum a rychlejší stabilizaci baseliny v porovnání se staršími ASRS/ADRS generacemi, což umožnilo dosažení nižších LOQ bez ztráty rozlišení.
• Praktické výsledky: Měřené koncentrace v testovaných dávkách laktózy byly ~0.18 µg/g (nitrit) a ~0.34 µg/g (dusičnan). Koloidní oxid křemičitý vykázal srovnatelnou hladinu nitritu (~0.187 µg/g) a mírně vyšší dusičnan (~0.39 µg/g).

Diskuse poukazuje na výhody suppressorové IC pro rutinní kontrolu excipientů: jednoduchá příprava vzorku, robustní separace a přímé měření bez potřeby derivatizace. Metoda však může narazit na matice s velmi vysokým obsahem chlóru nebo organických UV absorbentů, kde jsou potřeba dodatečné kroky (ředění, čištění nebo alternativní detekce jako UV/MS).

Přínosy a praktické využití metody

• Umožňuje spolehlivou kvantifikaci NO2- a NO3- na úrovních relevantních pro nitrosaminové hodnocení rizika v excipientech.
• NGES-A suppressor snižuje šum a dobu ustálení signálu, což snižuje potřebu častého zásahu operátora a zvyšuje propustnost laboratoře.
• Metoda je kompatibilní s farmakopeálními doporučeními a lze ji adaptovat na další excipienty za drobných úprav přípravy vzorku.
• Bez nutnosti derivatizace (v kontrastu k některým LC–MS nebo GC–MS postupům), což snižuje riziko chyb a kontaminace při přípravě vzorku.

Omezení

• Detekce založená na vodivosti může být ovlivněna vysokou iontovou silou matice (nutnost ředění nebo předčištění).
• Zatímco NGES-A zlepšuje stabilitu, některé velmi komplexní matrice mohou vyžadovat alternativní techniky (post-column Griess derivatizace, LC–MS/MS nebo headspace GC–MS) pro dosažení extrémně nízkých detekčních limitů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace IC s hmotnostní spektrometrií (IC–MS) pro zvýšenou selektivitu a nižší meze detekce bez nutnosti derivatizace.
• Automatizace a on-line předčištění vzorků pro snížení laboratorní práce a zvýšení reproducibility v kontrolních laboratořích.
• Další vylepšení suppressorů a detekčních elektronických postupů pro další snížení šumu a zkrácení doby ustálení baseliny.
• Rozšíření metodiky na širší spektrum excipientů a materiálů používaných v farmacii, včetně validace dle ICH a farmakopeálních standardů pro různé matrice.

Závěr

Metoda iontové chromatografie s NGES-A suppressorem prokázala vhodnost pro stopové stanovení nitritu a dusičnanu v laktóze monohydrátu a koloidním oxidu křemičitém. Díky sníženému šumu, rychlejší stabilizaci baseliny a dobrým analytickým parametrům (LOQ, lineárnost, přesnost a opakovatelnost) je metoda vhodná pro rutinní kontrolu kvality excipientů a podporu nitrosaminového rizikového hodnocení. Pro velmi složité matrice nebo potřebu extrémně nízkých detekčních limitů je vhodné zvážit kombinační přístupy (IC–MS, GC–MS nebo post-column derivatizaci).

Reference

1. Ahn, I.; Lee, S.; et al. Development and Application of Analytical Methods to Quantitate Nitrite in Excipients and Secondary Amines in Metformin API at Trace Levels Using Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry. Chemosensors 2025.
2. Baumann, M.; Naff, K. Quantification of Nitrite in Excipients and Chemicals: A Versatile and Highly Sensitive Method Using Headspace Gas Chromatography Coupled to Mass Spectrometry. Org. Process Res. Dev. 2024.
3. Mahendra, D.; Roy, R. Ion Chromatography in Pharmaceutical Analysis: Emerging Trends and Future Directions. Int. J. Pharm. Sci. 2025.
4. Kissner, R.; Koppenol, W. H. Qualitative and Quantitative Determination of Nitrite and Nitrate with Ion Chromatography. Methods Enzymol. 2005, 396, 61–68.
5. Hickert, S.; Naf, K.; et al. Nitrite Testing in Excipients: Industry Best Practices. Eur. J. Pharm. Sci. 2025.
6. Thermo Fisher Scientific Application Note. Determination of Nitrite in Pharmaceuticals: Application Note 73987.
7. Gerardi, H.; Feeley, L.; et al. Determining Low ppb Levels of Nitrite in Polymeric Excipients. ResearchGate Technical Note 2024.
8. USP Analytical Note. Determination of Nitrite and Nitrate in Lactose by Ion Chromatography as Part of Nitrosamine Risk Assessment in Excipients.
9. USP Analytical Note. Determination of Nitrite and Nitrate in Povidone by Ion Chromatography as Part of Nitrosamine Risk Assessment in Excipients.
10. USP Analytical Note. Quantification of Nitrite and Nitrate in Colloidal Silicon Dioxide by Ion Chromatography.