Determination of Fatty Acid Composition in Polysorbate 80 using HPLC with Charged Aerosol Detection

Význam tématu

Polysorbate 80 (Tween 80) je široce používaný neiontový surfaktant v léčivech, potravinách a kosmetice. Kontrola kvality surovin je klíčová pro bezpečnost hotových produktů, přičemž složení mastných kyselin v polysorbátu ovlivňuje jeho fyzikálně‑chemické vlastnosti a kompatibilitu s aktivními látkami. Tradiční postupy (GC‑FID s derivatizací) jsou časově náročné a pracovně intenzivní; použití HPLC s univerzálním detektorem CAD umožňuje rychlejší, citlivou a reprodukovatelnou analýzu bez potřeby složité derivatizace.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo vyvinout a validovat HPLC metodu s Charged Aerosol Detection (CAD) pro kvantitativní stanovení profilu mastných kyselin v surovinách polysorbatu 80. Studie se zaměřila na chromatografické rozdělení, optimalizaci parametrů CAD (evaporátor, filter time constant, power function value), stanovení linearity, LOQ a opakovatelnosti a aplikaci metody na reálné šarže polysorbatu 80 srovnáním s požadavky USP.

Použitá instrumentace

• LC systém: Arc HPLC System (Waters) s Column Heater/Cooler a Active Pre‑heater
• Detektor: Waters Charged Aerosol Detector (CAD)
• Kolona: XBridge BEH C18, 4.6 × 100 mm, 3.5 µm (Waters)
• Vialy: LCMS Maximum Recovery 2 mL
• Filtrace vzorků: GHP syringe filtry (Waters)
• Teploty: kolona 60 °C, vzorek 10 °C
• Mobilní fáze: A = 0.05 % kyselina mravenčí ve vodě; B = 0.05 % kyselina mravenčí v acetonitrilu
• Flow: 1.5 mL/min; injekční objem: 35 µL
• Nastavení CAD: PFV = 1.00, sampling rate = 10 pts/s, filter time constant = 1.4 s, evaporátor = 25 °C, ion trap voltage = 20 V
• SW: Empower 3.6.0 pro akvizici a zpracování dat

Použitá metodika

Standardy mastných kyselin byly připraveny v metanolu (1 mg/mL) a další zředění do 0.05–25 µg/mL (lineární oblast). Surový polysorbát 80 byl saponifikován 1 M KOH/methanol (90:10) na koncentraci 1.5 mg/mL a inkubován 6 h při 40 °C. Po saponifikaci byla směs neutralizována kyselinou mravenčí, extrahována MTBE, organická vrstva vysušena dusíkem a residuum rekonstituováno do diluentu (25:75 voda/acetonitril). Vzorky byly filtrovány před analýzou.

Hlavní výsledky a diskuse

• Chromatografické rozdělení: XBridge BEH C18 a kyselá voda/acetonitril eluční fáze umožnily separaci hlavních mastných kyselin přítomných v polysorbatu 80; mastné kyseliny, které nemají silný chromofor, poskytují silný a stabilní signál v CAD.
• Optimalizace CAD: evaporátor 25 °C dává vyšší S/N než vyšší teploty (25–35 °C), protože vyšší teploty snižují signál polosvolatile látek. Filter time constant 1.4 s maximalizoval S/N pro sledované kyseliny. PFV 1.00 poskytl nejlepší linearitu (R2 ≥ 0.99 pro většinu kyselin, s výjimkou myristové kyseliny), při zkoumaném koncentračním rozsahu 0.05–25 µg/mL se zpracováním dat lineárním fit s 1/x vážením.
• LOQ a opakovatelnost: LOQ se pohybovaly mezi 0.9 a 3.5 ng na koloně (S/N ≥ 10, průměr ze 6 injekcí). System suitability (10 opakovaných injekcí 10 µg/mL) ukázala RSD ≤ 0.48 % pro plochy a ≤ 0.02 % pro retenční časy.
• Analýza reálných šarží: v analyzovaných šaržích byla olejová frakce olejové kyseliny v rozmezí 68.3–82.4 %, což splňuje USP kritérium NLT 58.0 %. Vznikl rovněž další pík po oleické kyselině identifikovaný pomocí spike experimentu jako petroselinová kyselina.

Přínosy a praktické využití metody

• Metoda eliminuje nutnost časově náročné derivatizace (BF3‑metanol) potřebné pro GC‑FID, zjednodušuje přípravu vzorků a zvyšuje průchodnost laboratoře QC.
• CAD poskytuje univerzální a citlivou detekci pro látky bez chromoforu, vhodnou pro heterogenní matrici polysorbatu 80.
• Metoda vykazuje vysokou opakovatelnost, široký dynamický rozsah a nízké LOQ, což ji činí praktickou pro běžné testování surovin a ověřování shody s monografií USP.
• Plná integrace CAD s Empower SW usnadňuje zpracování dat, auditovatelnost a nasazení do regulovaných prostředí.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření použití CAD‑HPLC pro další nechromoforní excipienty a komplexní směsi, kde tradiční detektory selhávají.
• Další vylepšení softwarové korekce signálu (optimalizace PFV a algoritmů zpracování) pro zlepšení linearity u slabě reagujících analyz (např. myristové kyseliny).
• Možnost kombinace CAD s HRMS pro identifikaci neznámých vedlejších složek při zachování rutinní kvantifikace přes CAD.
• Automatizace přípravy vzorků (saponifikace/extrakce) pro zvýšení throughput a snížení variability operátora.

Závěr

Studie prokázala, že HPLC v kombinaci s Charged Aerosol Detection představuje spolehlivou, citlivou a reprodukovatelnou alternativu k tradičním GC metodám pro stanovení profilu mastných kyselin v polysorbatu 80. Optimalizace parametrů CAD (evaporátor 25 °C, filter time constant 1.4 s, PFV 1.00) byla klíčová pro dosažení nízkých LOQ, vynikající linearity a opakovatelnosti. Metoda je vhodná pro rutinní QC analýzy surovin a nabízí výhody v podobě jednodušší přípravy vzorků a lepší integrace do regulovaných workflow.

Reference

1. Uchi J. What is polysorbate? (web source)
2. Zhang R., Wang Y., Tan L., Zhang H.Y., Yang M. Analysis of Polysorbate 80 and its Related Compounds by RP‑HPLC with ELSD and Mass Detection. Journal of Chromatography Science. 2012;50:598–607.
3. Mondal B., Kote M., Lunagariya C., Patel M. Development of a Simple High Performance Liquid Chromatography (HPLC)/Evaporative Light Scattering Detector (ELSD) Method to Determine Polysorbate 80. Saudi Pharmaceutical Journal. 2020;28:325–328.
4. Ilko D., Braun A., Germershaus O., Meinel L., Holzgrabe U. Fatty Acid Composition Analysis in Polysorbate 80 with High Performance Liquid Chromatography Coupled to Charged Aerosol Detection. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 2015;94:569–574.
5. United States Pharmacopeia. USP Monograph for Polysorbate 80. USP–NF 2021 Issue 1. Official 01‑May‑2020.
6. Barnhart W.W., Farooq M.Q., Ahmad I.A.H.A. A Simplified Tutorial on Charge Aerosol Detection: Understanding the Basics, Optimization, and Troubleshooting. Journal of Chromatography Open. 2024;100181.
7. Schilling K., Holzgrabe U. Recent applications of the Charged Aerosol Detector for liquid chromatography in drug quality control. Journal of Chromatography A. 2020;1619:460911.
8. Vehovec T., Obreza A. Review of Operating Principle and Applications of Charged Aerosol Detector. Journal of Chromatography A. 2010;1217:1549–1556.
9. Gorecki T., Lynen F., Szucs R., Sandra P. Universal Response in Liquid Chromatography Using Charged Aerosol Detection. Analytical Chemistry. 2006;78:3186–3192.