Enhanced analytical flexibility: simultaneous normal and reversed phase chromatography

Význam tématu

Analýza vitamínů v komplexních doplňcích stravy vyžaduje metody schopné oddělit jak tukově rozpustné (FSV), tak vodou rozpustné vitamíny (WSV). Kombinace normal-phase (NP) a reversed-phase (RP) chromatografie umožňuje optimální separaci rozdílně polárních analytů. Použití jednoho UHPLC systému s hybridní konfigurací zvyšuje efektivitu, průchodnost a konzistenci výsledků v rámci rutinních kontrol kvality a farmaceutického či potravinářského výzkumu.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo prokázat, že systém Thermo Scientific Vanquish Flex Duo UHPLC vybavený NP kitem dokáže současně provozovat RP a NP chromatografii pro komplementární kvantifikaci vitamínů ve vícevitaminových tobolkách určených pro těhotné a kojící ženy. Metody byly provozovány podle příslušných USP monografií, čímž se minimalizuje potřeba opětovné validace metod.

Použitá metodika

Studie kombinovala dva nezávislé analytické toky: jeden pro NP analýzu vitaminu D3 (cholekalciferolu) a druhý pro RP analýzu vitamínů skupiny B (B1, B2, B3, B6) podle USP.

Hlavní kroky přípravy vzorků:

• Vitamin D3 (NP): standard 2 µg/mL v n‑hexanu; system suitability příprava zahrnovala zahřátí pod refluxem při 60 °C v dusíkové atmosféře k tvorbě precholekalciferolu; vzorky extrahovány DMSO/n‑hexanem, reflux 60 °C 1 h, separace, ředění v 50 mL balónku.
• WSV (RP, Method 2 USP): příprava dvou roztoků A (fosfát pH 3,0) a B (EDTA), extrakční roztok A:B 4:1; kapsle extrahovány zahřátím na 90 °C, přidána acetonitrilová fáze, filtrace 0,45 µm a analýza.

Chromatografické podmínky (shrnutí):

• RP: kolona Hypersil GOLD Amino 150 × 4.6 mm, 3 µm; mobilní fáze: aq. roztok sodné hexanesulfonátové soli + fosfát s 2,5 % acetonitrilu (Solvent A) a A:acetonitril (2:1) jako Solvent B; detekce 254 nm (B1, B3, B6) a 280 nm (B2); injekční objem 10 µL; teplota kolony 25 °C; autosampler 5 °C.
• NP: kolona Hypersil GOLD 150 × 4.6 mm, 5 µm; mobilní fáze n‑hexan/isopropanol; detekce 265 nm; injekční objem 100 µL; průtok 1 mL/min.

Datový systém: Chromeleon CDS 7.3.2.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Vanquish Flex Duo UHPLC System (System Base VF-S01-A-03) s nezávislými pumpami a detektory.
• Vanquish Dual Pump F, Vanquish Dual Split Sampler FT1, Vanquish Column Compartment H.
• Vanquish Variable Wavelength Detector F a Diode Array Detector HL (LightPipe / standardní flow cells).
• Normal Phase (NP) Kit VQ Flex Systems pro kompatibilitu se NP rozpouštědly.
• Laboratorní spotřební materiál a pomůcky: pipety Finpipette, filtr. injekční stříkačky, filtry 0,45 µm, DMSO, n‑hexan, acetonitril, IPA, analytické standardy USP apod.

Hlavní výsledky a diskuse

Simultánní provoz NP a RP na jednom instrumentu prokázal vysokou systematickou spolehlivost a shodu s USP kritérii:

• Vitamin D3 (NP): průměrná plocha píku standardu 17.54 mAU·min s RSD 0.13 % (USP limit ≤ 3 %). Rozlišení (Rs) mezi cholekalciferolem a precholekalciferolem bylo průměrně 12.8 (USP požadavek ≥ 10), čímž byla prokázána schopnost adekvátně separovat isomery.
• Kvantitativní určení vitaminu D3 ve vzorku (obsah z deklarovaných 10 mg) bylo 9.67 mg ± 0.01 mg, což je velmi blízko deklarované hodnotě.
• Water‑soluble vitamins (RP): standardní roztoky a systému suitability vykázaly velmi nízké RSD pro plochy píků (vše pod limitem USP 2.0 %), např. pyridoxin měl nejvyšší RSD 0.16 % v testu.
• Kvantifikace vitamínů B ve vzorcích (průměr z 6 injekcí) ukázala: niacinamid (B3) 13.5 mg vs etiketa 13.0 mg (103.8 %), pyridoxin (B6) 2.4 mg vs 2.5 mg (96.0 %), riboflavin (B2) 1.8 mg vs 1.6 mg (112.5 %), thiamin (B1) 1.4 mg vs 1.4 mg (100.0 %). Vše v rámci USP akceptačních mezí 90–125 %.

Chromatogramy a system suitability testy (přiložené v originálním dokumentu jako obrázky) ukazují dobrou opakovatelnost, symetrii píků a dostatečná rozlišení; tabulka s kvantifikací shrnuje naměřené hodnoty a % deklarovaného obsahu.

Přínosy a praktické využití metody

Simultánní provoz NP a RP na jedné platformě přináší následující výhody:

• Vyšší laboratořní průchodnost a efektivita díky paralelním separacím bez nutnosti přesunů vzorků mezi přístroji.
• Snížení nákladů na vybavení a údržbu (jeden systém spravuje obě separační techniky).
• Zachování souladu s USP monografiemi, což zjednodušuje regulatorní akceptaci výsledků.
• Možnost nasazení v kontrolách kvality doplňků stravy, farmaceutické analýze a R&D pro formulace obsahující směs lipofilních a hydrofilních vitamínů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možnosti rozšíření a budoucí využití této strategie zahrnují:

• Integrace dalších detectorů (MS) pro zvýšení selektivity a potvrzení identity v komplexních matricích.
• Automatizace přípravy vzorků a online ekstrakce pro zvýšení throughputu a snížení manuálních chyb.
• Validace více analyzovaných tříd sloučenin současně (např. vitaminy plus pesticidní rezidua nebo kontaminanty) s cílem komplexní kontroly kvality doplňků.
• Optimalizace kompatibility materiálů v autosampleru pro dlouhodobé používání NP rozpouštědel a vývoj robustních routine protokolů pro směsné matice.

Závěr

Studie ukázala, že Vanquish Flex Duo s NP kitem je schopný spolehlivě provádět současně NP a RP chromatografii pro analýzu vitaminů ve vícesložkových doplňcích. Metody splňují USP system suitability kritéria a výsledky kvantifikace jsou v rámci přijatelných limitů. Tento přístup zvyšuje analytickou flexibilitu a efektivitu laboratoří zabývajících se kontrolou kvality vitamínových produktů.

Reference

1. United States Pharmacopeia. (2021). Dietary Supplement Monographs: Water‑Soluble Vitamins Preparation. USP‑NF. Rockville, MD: United States Pharmacopeia.
2. United States Pharmacopeia. (2023). General Chapter {581}: Vitamin D Assay. USP‑NF. Rockville, MD: United States Pharmacopeia.