Quantitative Analysis of QACs in Milk Using a QuEChERs Sample Preparation Approach

Quantitativní stanovení QAC v mléce pomocí QuEChERS a LC-MS/MS

Význam tématu

Quaternární amoniové sloučeniny (QAC) jako benzalkonium chloridy (BAC) a didecyldimethylammonium chloride (DDAC) jsou běžně používány jako dezinfekční prostředky v dojnictví a potravinářské výrobě. Nedostatečné opláchnutí nebo nevhodné použití může vést k reziduím v syrovém mléce, která mohou ovlivnit kvalitu produktů (např. aktivitu startovacích kultur) nebo představovat toxikologické riziko. Citlivý a rutinně použitelný analytický postup pro detekci QAC v mléce je proto důležitý pro kontrolu jakosti, dohled nad bezpečností potravin a plnění legislativních požadavků.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout a ověřit rychlou, citlivou a robustní LC-MS/MS metodu pro současné kvantitativní stanovení devíti homologů QAC (BAC C8–C18 a DDAC C8–C12) v mléčném matrice. Studie ukazuje použití přístupů QuEChERS pro přípravu vzorků a analýzu na přístrojové sestavě Shimadzu (Nexera X3 + LCMS-8045RX) s dosahem LOQ vhodným pro dohled a kontrolu shody s obecnými reziduálními limity.

Použitá metodika

Postup přípravy vzorku:

• Vzorek: 10 g blank (nepřítomné) mléko, do kterého byl přidán 100 µL standardní směsi (100 ng/mL konečná koncentrace).
• Extrahováno standardním QuEChERS protokolem s použitím RESTEK Q‑Sep QuEChERS Extraction Packets (En Method).
• Další přečištění: mrazící depozice - surový extrakt zmrazen 2 hodiny a supernatant přenesen, aby se oddělily precipitáty (freeze‑out step).
• Kalibrace: matrix‑matched kalibrační standardy připravené ředěním spiked extraktu s blank extraktem; kontrolní vzorky (QC) připraveny z různých typů mléka (plnotučné, bio, horské).

Podmínky analýzy (shrnutí):

• Chromatografie: Shim-pack Velox SP‑C18 (100 × 2.1 mm, 2.7 µm), delay column Shim-pack GIST HP C18‑AQ (30 × 3 mm, 3 µm) použitá jako solvent delay pro oddělení chronických kontaminant QAC v systému.
• Mobilní fáze: 5 mM amonný formiát + 0.01 % kyselina formová ve vodě (Pump A) a v methanolu (Pump B).
• Injekce: 1 µL; doba analýzy: 12 minut; teplota kolony 40 °C, chladič 15 °C.
• Detekce: LCMS-8045RX, ESI v pozitivním módu, MRM akvizice s minimálně dvěma přechody na sloučeninu.
• Kalibrace: vážená (1/konc.) lineární regrese v rozsahu 2.5–100 ng/mL.

Použitá instrumentace

• Nexera X3 UHPLC (Shimadzu)
• LCMS-8045RX triple‑quadrupole (Shimadzu) s ESI+
• Analytický sloupec: Shim-pack Velox SP‑C18 (100 × 2.1 mm, 2.7 µm)
• Delay column: Shim-pack GIST HP C18‑AQ (30 × 3 mm, 3 µm)
• RESTEK Q‑Sep QuEChERS Extraction Packets pro extrakci

Hlavní výsledky a diskuse

• Detekované látky: devět QAC (BAC‑C8, C10, C12, C14, C16, C18 a DDAC‑C8, C10, C12).
• Linearita: kalibrační křivky v rozsahu 2.5–100 ng/mL, koeficient determinace R² > 0.999 pro všechny analyty, vážená regrese (1/konc.).
• Citlivost: LOQ stanovena konzervativně na 2.5 ng/mL (odpovídá 2.5 µg/kg), což je výrazně pod obecnou residuální mezí 0.01 mg/kg (10 ng/mL) aplikovanou v rámci obecné legislativy.
• Reprodukovatelnost a přesnost: výsledky QC napříč třemi typy mléka a třemi úrovněmi (7.5, 30, 80 ng/mL) vykázaly přesnost přibližně 80–96 % a relativní standardní odchylky obvykle v intervalu ~0.5–7 % v závislosti na sloučenině a koncentraci. Tato data ukazují vhodnost metody pro rutinní testování.
• Praktické poznámky: vzhledem k běžné přítomnosti QAC v prostředí bylo implementováno řešení s delay column k oddělení systémových / rozpouštědlových kontaminací od analytů pocházejících ze vzorku.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlý a jednoduchý workflow: QuEChERS extrakce s jediným krokem freeze‑out minimalizuje pracovní čas a spotřebu rozpouštědel, což je vhodné pro vysoký průtok vzorků v rutinních laboratořích.
• Vysoká citlivost a selektivita díky MRM na triple‑quad, umožňující spolehlivé stanovení QAC pod legislativními nebo doporučenými limity.
• Metoda je použitelná pro monitorování reziduí v surovém mléce a pro kontrolu vlivu dezinfekce na procesy zpracování mléka (např. narušení startovacích kultur).

Budoucí trendy a možnosti využití

• Harmonizace MRL: očekává se tlak na sjednocení regulačních limitů pro QAC napříč státy, což zvýší potřebu validovaných rutinních metod s nízkým LOQ.
• Automatizace přípravy vzorků a integrace s laboratorními informačními systémy pro vyšší throughput a konzistenci výsledků.
• Rozšíření panelu sledovaných povrchově aktivních látek a kombinace s HRMS (high‑resolution MS) pro neznámé nebo vzácné QAC homology a metabolity.
• Optimalizace přípravy vzorku (filtrace, solid‑phase extraction nebo disky) pro ještě lepší potlačení matricových efektů v složitých potravinářských matricích.

Závěr

Popsaná metoda kombinuje jednoduchou QuEChERS přípravu s krátkou chromatografií a MRM detekcí na LCMS-8045RX, což umožňuje citlivé a reprodukovatelné stanovení devíti QAC v mléce. LOQ 2.5 ng/mL, linearita R² > 0.999 a QC výsledky (přesnost ~80–96 %, RSD obvykle <7 %) potvrzují vhodnost postupu pro rutinní monitorování reziduí. Implementace delay column minimalizuje vliv systémových kontaminací a celkově zabezpečuje robustnost metody při vysokém průtoku vzorků v provozních laboratořích.

Reference

1. Analysis of BACs and DDAC in Milk using QuEChERS method and LC‑MS/MS, Version 2, EU Reference Laboratory for Pesticides Requiring Single Residue Methods, CVUA Stuttgart, Fellbach, Germany.