Improved Oligonucleotide SPE-LC-MS Analysis Using MaxPeak High Performance Technology

Význam tématu

Potřeba vysoce selektivních a citlivých bioanalytických metod pro oligonukleotidové terapie ONT roste s rozvojem nových léků založených na antisense a dalších sekvencích. Tyto molekuly představují analytickou výzvu vzhledem k jejich velikosti, polyanionické povaze a náchylnosti k nespecifické adsorpci a vazbě na proteiny. Optimalizované SPE-LC-MS techniky umožňují přesnou detekci a kvantifikaci v komplexních biologických matricích.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo vyvinout jedinou robustní metodu pro extrakci a kvantifikaci oligonukleotidů délky 15–35 thymidinů (OST standard) a plně fosforothioátového antisense oligonukleotidu GEM91. Metoda kombinuje µElution SPE, reverzně fázovou UPLC chromatografii na sub-2 µm PREMIER kolóně a tandem kvadrupólovou MS detekci.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky připraveny µElution 96-well SPE destičkami Oasis HLB a WAX, včetně fenol-chloroformové LLE před WAX SPE u plazmy.
• Chromatografie na ACQUITY UPLC I-Class PLUS se sub-2 µm ACQUITY PREMIER Oligonucleotide C18 kolónou (2.1×50 mm) při 50 °C.
• Mobilní fáze A: 150 mM HFIP a 5 mM hexylamin ve vodě; mobilní fáze B: 150 mM HFIP a 5 mM hexylamin v methanolu; průtok 0.6 mL/min.
• Detekce Xevo TQ-XS Tandem Quadrupole MS, ESI-, režim MRM, kapilární napětí 2 kV, desolvace 500 °C.
• Softwarové řízení a kvantifikace: MassLynx v4.2 a TargetLynx.

Hlavní výsledky a diskuse

• MaxPeak High Performance Surface na PREMIER kolóně minimalizoval kovové interakce a omezil nespecifickou adsorpci oligonukleotidů oproti standardním BEH kolónám.
• Optimalizované SPE protokoly: HLB SPE s TEA/HFIP/MeOH pre-treatment a ACN/TEA elucí; WAX SPE wash s NH4OAc/MeOH a eluce s TEA/MeOH.
• LLE-WAX SPE extrakce plazmy dosáhla >80 % recoverie a umožnila LLOQ 0.0025 nmol/mL pro OST 15 mer a 50 ng/mL pro GEM91.
• Stabilita chromatografických parametrů (retention time, velikost piku) zachována až do 96 injekcí bez dlouhé passivace.

Přínosy a praktické využití metody

Kombinace µElution SPE, PREMIER kolóny a MRM detekce poskytuje robustní platformu pro bioanalýzu oligonukleotidových léčiv v preklinických a klinických studiích. Metoda šetří čas díky eliminaci odparu vzorků a minimalizuje ztráty analytu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Adaptace na nové generace modifikovaných oligonukleotidů a konjugátů.
• Integrace víceeruvých hmotnostních analyzátorů pro širší škálu analyzovaných molekul.
• Automatizace předúpravy vzorků a SPE pro vysokopropustné screeningové aplikace.
• Další povrchové úpravy kolón pro eliminaci kovových interakcí s dalšími biopolymery.

Závěr

Vyvinutá SPE-LC-MS metoda na bázi MaxPeak technologie a µElution SPE nabízí vysoce citlivou, selektivní a rychlou analytickou platformu pro kvantifikaci oligonukleotidových léčiv. Zlepšená návratnost a nízké LLOQ umožňují spolehlivou bioanalytiku v komplexních matricech.

Reference

• GEM91 image, accessed 18 September 2020.