Advancing plasma proteomics: Quantitative and high-throughput EV analysis with automated Mag-Net workflow, Evosep One, and Orbitrap Astral mass spectrometer

Význam tématu

Plazmatická proteomika má klíčový význam v translaci výzkumu do klinické praxe: umožňuje identifikaci biomarkerů, sledování onemocnění a pochopení molekulárních mechanismů. Hlavním analytickým problémem je extrémně široký dynamický rozsah proteinů v plazmě a přítomnost interferujících složek, což omezuje detekci nízceabundantních markerů. Enrichování extracelulárních vezikul (EV) z plazmy představuje účinný způsob, jak se zaměřit na biologicky relevantné podmnožiny proteomu a zvýšit citlivost pro nízcehořadé proteiny.

Cíle a přehled studie

Cílem technické poznámky bylo demonstrovat plně automatizované, škálovatelné řešení pro analýzu plazmatického EV-proteomu, které zlepší průchodnost, citlivost a reprodukovatelnost. Autoři integrovali miniaturizovaný Mag-Net protokol pro obohacení EV s automatizovaným nahráváním peptidů na Evotipy (OT-2 liquid handler) a separací na Evosep One, následovanou měřením na Orbitrap Astral masovém spektrometru. Studie porovnávala „neat“ workflow (zředěná plazma, bez EV-enrichment) a Mag-Net obohacení napříč různými poměry lidské a slepičí plazmy pro hodnocení kvantitativní přesnosti, preciznosti a hloubky pokrytí proteomu.

Použitá metodika a instrumentace

Popis protokolu (vybrané klíčové kroky):

• Vstupní materiál: Mag-Net workflow pracoval se 4 µL plazmy; neat workflow využíval 1 µL plazmy zředěné 180×.
• Mag-Net obohacení: vzorek smíchaný s pufrem pro navázání (Bis-Tris Propane, NaCl, pH 6.5) a MagReSyn SAX (resp. Hydroxyl) magnetickými perličkami; provedeny tři 12minutové inkubační kroky následované třemi promývacími kroky.
• Solubilizace a alkylace: „one-pot“ pufr obsahující 1 % SDS, redukční činidlo (TCEP) a alkylant (CAA) při inkubaci na deskách.
• On-bead agregace proteinů pomocí acetonitrilu, wash a následná 4hodinová digestace trypsinem a LysC; použitá množství enzymů byla v nízkém nanogramovém rozsahu (v protokolech se uvádí rozmezí ~10–75 ng LysC a ~40–300 ng trypsinu podle kroku a miniaturizace).
• Po digesci bylo ~40 % digestu přímo naloženo na Evotipy pomocí OT-2 automatizace a separováno na Evosep One (metody 60 SPD a Whisper Zoom 40 SPD, teplota kolony 40 °C).
• MS akvizice: Orbitrap Astral MS s full MS rozlišením 240 000, rozsah m/z 380–980, full MS AGC 500 %; MS/MS: izolace 3 Th, max. inj. čas 7 ms, HCD při 25 % NCE.
• Data processing: DIA-NN (library-free, Uniprot reviewed human proteome, trypsin/P, až 2 chybějící štěpení). Kvantifikace byla vyhodnocena pomocí maticově srovnaných kalibračních křivek (směs lidské a slepičí plazmy v různých poměrech).

Hlavní výsledky a diskuse

• Hloubka identifikací: neat workflow při 60 SPD identifikoval >950 proteinových skupin a >7 000 precursorů pro 100 % lidskou plazmu; Mag-Net workflow zásadně zvýšil pokrytí: >4 000 proteinových skupin a ~27 000 precursorů při 60 SPD, a až ~5 000 proteinových skupin a ~35 000 precursorů při Whisper Zoom 40 SPD.
• Kvantitativní přesnost a preciznost: obě pracovní postupy vykázaly vysokou přesnost při směrových kalibračních experimentech; medián CV byl menší než 16 % pro 60 SPD a menší než 15 % pro Whisper Zoom 40 SPD na úrovni proteinových skupin, což indikuje dobrou reprodukovatelnost i napříč širokým dynamickým rozsahem.
• Výhody EV-enrichování: Mag-Net selektivně obohacuje membránové partekuly a EV, čímž se redukuje interferenční pozadí a umožňuje detekci nízceabundantních EV-proteinů. Automatizace snižuje manuální variabilitu a zvyšuje propustnost pro větší kohortní studie.
• Výkon Astral MS: Orbitrap Astral poskytl vysoké rozlišení a rychlou akvizici, což přispělo k hlubokému pokrytí proteomu i při vyšších průchodnostech (SPD), s minimální kompromitací mezi rychlostí a citlivostí.

Přínosy a praktické využití metody

• Metoda nabízí plně automatizované end-to-end řešení vhodné pro středně velké až velké kohortní studie zaměřené na EV-biomarkery v plazmě.
• Miniaturizovaný vstup (µL rozsah) a on-bead digestion s přímým nahráváním na Evotip zkracují čas přípravy a snižují ztráty, což je výhodné pro vzácné nebo limitované vzorky.
• Vysoká hloubka identifikací a dobrá kvantitativní reprodukovatelnost jsou přínosem pro objevné studie biomarkerů, monitorování onemocnění a longitudinální analýzy.
• Platforma je přizpůsobitelná: uživatelé si mohou zvolit prioritu mezi maximálním počtem identifikací (Whisper Zoom 40 SPD) a vyšší průchodností (60 nebo 100 SPD) s minimálním kompromisem díky výkonu Astral MS.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další automatizace a standardizace pracovních postupů pro klinické nasazení a multi-center studie.
• Integrace cílených přístupů (PRM/SRM) nebo imunoprecipitace pro validaci vybraných EV-biomarkerů získaných z objevné fáze.
• Vývoj metodiky pro single-EV proteomiku a kombinaci s multi-omics (EV-RNA, lipidomika) pro komplexnější biologické profily.
• Pokročilá analýza dat využívající strojové učení pro lepší rozlišení biologických signálů od technického šumu a pro robustní prediktivní modely.
• Technologický vývoj MS (ještě rychlejší skenování, vyšší dynamický rozsah) bude dále zvyšovat citlivost a použitelnost pro velmi nízceabundantní analyty v plazmě.

Závěr

Kombinace Mag-Net EV-enrichování, automatizovaného nahrávání na Evotipy/Evosep One a měření na Orbitrap Astral MS představuje výkonnou platformu pro hlubokou a reprodukovatelnou analýzu plazmatického EV-proteomu. Metodika významně rozšiřuje schopnost detekovat nízceabundantní proteiny v krevní plazmě při vysoké průchodnosti, čímž usnadňuje objevování biomarkerů a podporuje širší využití plazmatické proteomiky v klinickém výzkumu. Platforma je vhodná pro rozsáhlé studie, přičemž další kroky zahrnují standardizaci, validaci biomarkerů a integraci cílených postupů pro klinický překlad.

Reference

1. Anderson NL, Anderson NG. The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects. Mol. Cell Proteomics. 2002 Nov;1(11):845–67.
2. Xu R, Greening DW, Zhu HJ, Takahashi N, Simpson RJ. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. J. Clin. Invest. 2016 Apr 1;126(4):1152–62.
3. Wu CC, Tsantilas KA, Park J, Plubell D, Naicker P, Govender I, et al. Mag-Net: Rapid enrichment of membrane-bound particles enables high coverage quantitative analysis of the plasma proteome. bioRxiv [Preprint]. 2024 Apr 2:2023.06.10.544439.
4. Pino LK, Searle BC, Yang HY, Hoofnagle AN, Noble WS, MacCoss MJ. Matrix-matched calibration curves for assessing analytical figures of merit in quantitative proteomics. J. Proteome Res. 2020;19(3):1147–1153.