Uncovering biological differences at scale

Význam tématu

Plasmová proteomika umožňuje rozsáhlou charakterizaci oběhových bílkovin s minimální invazivitou. Díky široké dynamické koncentraci proteinů v plazmě dokáže odhalovat biomarkery časného stadia onemocnění a sledovat systémové změny spojené s progresí chorob i odpovědí na léčbu. Výzvou zůstává zachytit nízkoodstupňové proteiny skryté pod hustou vrstvou vysoce abundantních proteinů, zajistit vysokou reprodukovatelnost a měřit kvalitativně i kvantitativně v rámci rozsáhlých studií.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat, jak integrace workflow Proteograph ONE s hmotnostním spektrometrem Orbitrap Astral Zoom zvyšuje hloubku, kvantitativní robustnost a reprodukovatelnost analýzy plasmatického proteomu. Auto­matizované nanopartikelové obohacení bylo kombinováno s vysokorychlostní a citlivou chromatografií UHPLC a vysoce rozlišujícím spektrometrem, aby se překonaly překážky ve formě širokého dynamického rozsahu a detekce nízkoodstupňových proteinů.

Použitá metodika

Workflow spočívalo v následujících krocích

• Nanopartikelové obohacení bílkovin z 120 µl lidské plazmy pomocí Proteograph ONE s inkubací 37 °C
• Automatizované praní a odstraňování nespecificky vázaných proteinů
• Redukce, alkylace a enzymatická digestace Trypsinem/Lys-C
• Čištění peptidů a jejich kvantifikace fluorometrickou metodou
• Separace peptidů na Vanquish Neo UHPLC systémech s trap-elute i přímou injekcí
• Měření na Orbitrap Astral Zoom MS za podmínek nastavených na rychlé (60 vzorků/den) a hloubkové (16 vzorků/den) analýzy

Použitá instrumentace

• Seer Proteograph ONE Assay a SP200 automatizační přístroj
• Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC systém
• Orbitrap Astral Zoom hmotnostní spektrometr
• Savant SpeedVac koncentrátor

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda 16 vzorků/den dosáhla v mediánu 9047 skupin proteinů a 116 379 peptidů, verze 60 vzorků/den zaznamenala 6770 proteinových skupin a 69 146 peptidů. Technická variabilita byla nízká (%CV proteinů ~4,2–4,3, peptidů ~8,1–8,9). Obě nastavení pokryla dynamický rozsah 8–9 řádů. Celkově 60 vzorků/den identifikovalo 8213 proteinových skupin napříč vzorky, 16 vzorků/den až 10 769. Z 11 357 celkových skupin proteinů měly obě metody 67% společných, 28% unikátních pro hloubkovou a 5% pro rychlou. Workflow zachytil 74 schválených biomarkerů a zjistil přes 1200 rozdílně exprimovaných proteinů mezi pacienty s karcinomem plic a zdravými jedinci. Obohacené dráhy zahrnovaly imunitní odpověď, chemotaxi, remodelaci tkání a hemostázu, což potvrzuje biologický význam nasnímaných změn.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda kombinuje vysokou průchodnost se širokým krytím plasmatického proteomu, umožňuje identifikaci kandidátních biomarkerů v rozsáhlých kohortách a nabízí robustní platformu pro klinické a translaci výzkumné projekty. Díky automatizaci a nízké technické variabilitě ji lze aplikovat pro QA/QC v průmyslové analytice a personalizovanou medicínu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další integrace s multi-omickými přístupy, zlepšení nanopartikelových povrchů pro cílenější obohacení a rozšíření analyzovaných vzorků o jiné biologické tekutiny. V kombinaci se strojovým učením a automatizovanou analýzou dat lze získat širší poznatky o patogenezi onemocnění a vyvíjet přesnější diagnostické testy.

Závěr

Integrace Proteograph ONE a Orbitrap Astral Zoom MS přináší vyváženou platformu pro vysokoprůchodovou i hloubkovou plasmatickou proteomiku s vynikajícím pokrytím dynamického rozsahu, nízkou variabilitou a schopností odhalit biologicky i klinicky relevantní změny proteomu.

Reference

1. Ignjatovic V et al J Proteome Res 2019;18:4085
2. Blume JE et al Nat Commun 2020;11:3662
3. Geyer PE et al EMBO Mol Med 2019;11
4. Geyer PE et al J Proteome Res 2024;23:44
5. Anderson NL Clin Chem 2010;56(2):177