Efficient sustainable online SPE-UHPLC workflow for the determination of bitter acids in hops

Efektivní udržitelná online SPE‑UHPLC metoda pro stanovení hořkých kyselin v chmelu

Význam tématu

Hořké kyseliny (α‑acidy: humulony; β‑acidy: lupulony) jsou klíčovými složkami chmele určujícími hořkost a aroma piva. Přesné a rychlé stanovení jejich obsahu je pro pivovary i dodavatele chmele zásadní pro řízení receptur (IBU) a zajištění konzistence produktů. Současně je důležité minimalizovat čas analýzy, chemické odpady a používání toxických rozpouštědel, což podporuje zájem o online SPE řešení a zelené extrakční postupy.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo vyvinout a ověřit zkrácený, plně automatizovaný a ekologičtější workflow pro kvantifikaci α‑ a β‑hořkých kyselin v chmelu pomocí Vanquish Online SPE UHPLC systému. Metoda měla umožnit rychlé vzorkování, nízkou spotřebu rozpouštědel, vysokou reprodukovatelnost a dostatečné rozlišení kritických párů izomerů.

Použitá metodika

- Extrakce: 100 mg drceného chmele extrahováno 5 mL 80% ethanolu, ultrazvuk 45 min při pokojové teplotě, následovalo centrifugování 5 min při 4 700 g a následné přenesení supernatantu s dalším centrifugováním 11 180 g (filtrace vynechána). Vzorky skladovány při −20 °C.
- Kalibrace: ICE‑4 mezinárodní standard (s definovaným poměrem α a β kyselin). Stock 1.139 mg/mL v acetonitrilu, čtyřbodová kalibrační křivka (100%, 75%, 50%, 25%).
- Online SPE a chromatografie: SPE fáze na Hypersil GOLD C8 pro zachycení interferentů a prečištění; analytická separace na Hypersil GOLD C18 Selectivity (100 × 2.1 mm, 1.9 µm). Mobilní fáze: 0.1% kyselina mravenčí ve vodě (A) a v acetonitrilu (B). Optimalizovaný běh umožnil dobu analýzy 15 min.
- Podmínky: teplota kolony 35 °C, autosampler 5 °C, injekční objemy 5 µL (standardy) a 1 µL (vzorky), detekce UV při 270 nm (data rate 20 Hz, response 0.2 s).

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Vanquish Flex Online SPE UHPLC system (System Base Vanquish Duo; Dual Pump F; Split Sampler FT; Column Compartment H; Variable Wavelength Detector F)
• Hypersil GOLD C8, 5 µm, 20 × 2.1 mm (online SPE)
• Hypersil GOLD C18 Selectivity, 1.9 µm, 100 × 2.1 mm (analytická kolona)
• Semi‑micro flow cell 2.5 µL, SST; Chromeleon CDS pro akvizici a vyhodnocení

Hlavní výsledky a diskuse

- Separace a analytické parametry: Optimalizovaná metoda dosáhla rozlišení humulone/adhumulone 2.29 a lupulone/adlupulone 1.06, což umožnilo spolehlivou kvantifikaci nebo v souladu s ASBC sumarizaci vybraných párů (humulone+adhumulone a lupulone+adlupulone).
- Výkonnost: Kalibrační křivky vykázaly vysokou linearitu (R² > 0.995). RSD hodnoty peak area pro standard ICE‑4 byly velmi nízké (typicky <0.6% při různých koncentracích); reprodukovatelnost opakovaných měření vzorků byla vysoká (SD <0.50 %, n = 6).
- Spotřeba a čas: Online SPE krok trvá cca 2 minuty ve srovnání s 30–60 minutami u manuálních offline SPE postupů. Celková spotřeba mobilních fází na analýzu byla <8 mL, což výrazně snižuje chemické odpady.
- Profilace chmelových odrůd: Analyzovány čtyři odrůdy: Sultana, Sabro, Barbe Rouge a Azacca. Humulone+adhumulone dominovaly ve všech druzích: Sultana 9.15 ± 0.11 %, Sabro 9.30 ± 0.15 %, Barbe Rouge 4.39 ± 0.20 %, Azacca 4.67 ± 0.19 %. Cohumulone: Sultana 3.35 ± 0.11 %, Azacca 3.08 ± 0.19 %, Sabro 2.73 ± 0.14 %, Barbe Rouge 1.39 ± 0.20 %. Lupulone+adlupulone: Sultana 1.79 ± 0.11 %, Barbe Rouge 1.81 ± 0.10 %, Sabro 2.39 ± 0.09 %, Azacca 1.29 ± 0.20 %. Tyto rozdíly určují vhodnost jednotlivých odrůd pro různé stupně hořkosti piva (Sultana, Sabro vhodné pro vyšší IBU; Barbe Rouge pro jemnější hořkost).

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlost a throughput: výrazné zkrácení času na přípravu vzorku díky online SPE a paralelnímu mytí/equilibrování kolony.
• Snížení spotřeby rozpouštědel a odpadu: celková spotřeba mobilních fází <8 mL a použití 80% ethanolu pro extrakci místo toxičtějších rozpouštědel.
• Automatizace a reprodukovatelnost: menší riziko chyb operátora, stabilní RSD a vysoká linearita kalibrací vhodné pro rutinní QC.
• Možnost přímého nasazení v analytických laboratořích pivovarů a dodavatelů chmele pro rychlé profilování a kontrolu kvality.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metody: zavedení hmotnostní spektrometrie (LC‑MS) pro zvýšení selektivity a snižování detekčních mezí, umožňující stanovení nižších hladin a doplňkových sloučenin (např. prenylované flavonoidy jako xanthohumol).
• Standardizace workflow: širší přijetí online SPE‑UHPLC metod v průmyslových normách pro harmonizaci stanovení hořkých kyselin.
• Zelené technologie: další snižování environmentální stopy např. recyklací rozpouštědel, použitím biobázíovaných rozpouštědel a minimalizací spotřebních materiálů.
• Automatizované inline monitorování: integrace do výrobních linek pivovarů pro feedback v reálném čase a optimalizaci extrakce/varu.

Závěr

Online SPE‑UHPLC postup implementovaný na Vanquish Flex systému poskytuje rychlé, přesné a ekologičtější řešení pro kvantifikaci hořkých kyselin v chmelu. Metoda kombinuje dobré chromatografické rozlišení, vysokou reprodukovatelnost a nízkou spotřebu rozpouštědel, což ji předurčuje pro rutinní použití v kontrolách kvality chmele a optimalizaci pivních receptur.

Reference

1. Marques S.P.D., Owen R.W., da Silva A.M.A., Neto M.L.A., Trevisan M.T.S. QuEChERS extraction for quantitation of bitter acids and xanthohumol in hops by HPLC‑UV. Food Chemistry, 2022, 388, 132964. DOI: 10.1016/j.foodchem.2022.132964
2. Duarte L.M., Aredes R.S., Amorim T.L., de Carvalho Marques F.F., de Oliveira M.A.L. Determination of α‑ and β‑acids in hops by liquid chromatography or electromigration techniques: A critical review. Food Chemistry, 2022, 397, 133671. DOI: 10.1016/j.foodchem.2022.133671
3. Heidorn M. Thermo Fisher Scientific Application Brief 155: Monitor the brewing process with LC‑transformation of hop α‑acids into beer iso‑α‑acids. 2016.