Analysis of C=C Positions of Lipids in Mouse Brain Sections Using MALDI-OAD-MS/MS

Význam tématu

Analýza polohy dvojných vazeb (C=C) v lipidových molekulách je klíčová pro pochopení lipidové biochemie, metabolismu a prostorové distribuce lipidů v tkáních. Metoda, která umožňuje určit pozice C=C přímo v tenkých řezech tkáně bez extrakce, zrychluje vyšetření vzorků, zachovává prostorové informace a otevírá možnosti pro aplikace v lipidomice, patofyziologii a zobrazovací analýze mozku.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo demonstrovat použití kombinace zobrazovací hmotnostní spektrometrie (MALDI) s novou radikálově založenou metodou Oxygen Attachment Dissociation (OAD-MS/MS) pro lokalizovanou identifikaci polohy C=C v lacích v řezech myšího mozku. Autoři ukazují, že přístup je použitelný pro oba iontové režimy (pozitivní i negativní) a pro různé aduktové formy (protonované i kovově aduktované ionty), přičemž zachovává prostorové rozlišení pro zobrazovací analýzu.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: zmrazené řezy myšího mozku tloušťky 10 µm nanesené na ITO skla; před nanesením matrice byly řezy třikrát promyty 50 mM roztokem formiátu amonného při 4 °C, aby se odstranily narušené soli a kovové ionty.

Matrice a nanášení: 2,5-dihydroxybenzoová kyselina (DHB) nanesená systémem iMLayer ve vrstvě o tloušťce ~1,2 µm.

Hmotnostní spektrometrie a OAD: kombinace obrazovacího MALDI přístroje iMScope QT se systémem OAD-TOF (LCMS-9050 vybavený OAD RADICAL SOURCE I). OAD generuje neutrální radikály (O/OH•) z vodní páry v mikrovlnném zdroji; radikály jsou přiváděny do Q2 (OAD buňky) přes křemennou trubici, kde selektivně oxidují a štěpí C=C vazby, čímž produkují charakteristické fragmenty indikující polohu dvojných vazeb.

Podmínky zobrazovací MSI (shrnutí klíčových parametrů z tabulky): polarita pozitivní/negativní; teplota DL ~290 °C; heat block ~400 °C; rozsah MS/MS m/z 500–920; prostorové rozlišení (pitch) 50 µm; nastavení průměru laseru 4; intenzita laseru 75; frekvence 100 Hz; šířka Q1 ~5.0 Da; kolizní energie ~10 V.

Software: IMAGEREVEAL MS pro vizualizaci a interpretaci OAD-MS/MS spekter a lokalizaci lipidových izomerů.

Hlavní výsledky a diskuse

1) Pozitivní iontový režim: po promytí formiátem amonným byla membránová fosfolipidová molekula PC 16:0_18:1 detekována jako [M+H]+ (m/z 760.584) a také v aduktové formě [M+K]+ (m/z 798.543). OAD-MS/MS oběma aduktům poskytlo fragmenty charakteristické pro izomery s dvojnými vazbami n-7 a n-9. V cerebellární oblasti bylo zjištěno, že izomer n-9 je přítomen v několikanásobně vyšší množství než n-7. Studie potvrdila, že OAD dobře pracuje i s protonovanými prekurzory, ne pouze s kovovými adukty.

2) Negativní iontový režim: u sulfatidu SHexCer d18:1/24:1 ([M−H]−, m/z 888.623) OAD-MS/MS odhalilo fragmenty odpovídající dvěma polohám dvojných vazeb, konkrétně Δ4 v sfingoidové bázi a n-9 ve vyšší mastné kyselině, což dokládá použití metody i pro aniontové lipidy.

3) Mechanistický aspekt: OAD generuje radikálové útoky na C=C vazby prostřednictvím O/OH•, což vede k selektivnímu štěpení v okolí dvojné vazby a tvorbě charakteristických neutrálních ztrát a fragmentů umožňujících lokalizaci vazby; použití neutrálních radikálů vysvětluje nezávislost na iontové polaritě prekurzoru.

4) Zobrazovací přínos: kombinace s iMScope QT a IMAGEREVEAL MS umožnila prostorové mapování izomerů v cerebellu bez extrakčního kroku, zachovávající biomolekulární lokalizaci.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost rychlé a přímé lokalizace polohy C=C v lipidových molekulách přímo v tkáňových řezech bez nutnosti extrakce či chemické derivatizace.
• Metoda je univerzální vůči iontové polaritě a typu aduktu (protonované i alkali-metalické), což zvyšuje její praktičnost v rutinních MSI experimentech.
• Umožňuje prostorové rozlišení distribuce izomerů v tkáni, což je užitečné pro studie metabolismu, neurochemie a patologických změn v mozku.
• Rychlost a relativní jednoduchost přípravy vzorku (promytí formiátem, nanesení DHB) usnadňují implementaci do laboratorních workflow.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření aplikace OAD-MSI na širší spektrum lipidových tříd a dalších nenasycených biomolekul (např. steroidy, deriváty mastných kyselin).
• Integrace s kvantitativními přístupy a standardy pro zlepšení přesnosti měření izomerových poměrů v rámci biologických studií.
• Vylepšení prostorového rozlišení a citlivosti (menší pitch, optimalizace laseru) pro aplikace na substrukturální úrovni, např. analýzu vrstev v mozku nebo malých anatomických struktur.
• Kombinace OAD s jinými fragmentačními technikami (CID, ETD apod.) pro komplexní strukturální rozbory a potvrzení identifikací.
• Potenciální přechod směrem k klinickým a diagnostickým aplikacím v lipidomice, patologie a farmakometabolomice, pokud budou vyřešeny otázky standardizace a validace.

Závěr

MALDI-OAD-MS/MS implementované na systému iMScope QT ve spojení s OAD-TOF přináší robustní a přímočaře použitelný přístup pro určení pozic dvojných vazeb v lipidech přímo v tkáňových řezech. Metoda funguje v obou iontových režimech a pro různé aduktové formy, nevyžaduje extrakci lipidů a umožňuje zachovat prostorovou informaci, což ji činí perspektivní pro výzkum lipidomiky a zobrazovací molekulární analýzu.

Reference

1. Takahashi H. et al., Analytical Chemistry, 2018, 90(12), 7230–7238.
2. Takahashi H. et al., Mass Spectrometry, 2019, S0080.
3. Uchino H. et al., Communications Chemistry, 2022, 5, 162.
4. Peggi M., Angel A. et al., Analytical Chemistry, 2012, 84(3), 1557–1564.