Multidirectional Analysis of Plant Alkaloids Using MS Imaging and OAD-TOF System

Význam tématu

Distribuční a strukturální analýza rostlinných alkaloidů je klíčová pro farmakologický výzkum, bezpečnost potravin a pochopení obranných mechanismů rostlin. Kombinace hmotnostně‑spektrometrického zobrazování (MSI) pro lokalizaci sloučenin v tkáních a cílených MS/MS technik pro detailní strukturální informaci zvyšuje schopnost identifikovat známé i nové alkaloidy přímo v tkáňovém kontextu. Popisovaná kombinace iMScope QT a OAD‑TOF přináší vyšší jistotu při určování polohy dvojných vazeb a rozlišení strukturálních izomerů, což má přímý dopad na objevování biologicky významných látek a jejich aplikace v praxi.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo demonstrovat možnost víceúrovňové analýzy rostlinných glykoalkaloidů (konkrétně solaninu a chakoninu) v klících brambor pomocí MS imagingu a následné strukturální ověření kombinací Oxygen Attachment Dissociation (OAD) MS/MS a klasického Collision Induced Dissociation (CID) MS/MS. Studie hodnotila prostorové rozložení alkaloidů v řezích tkáně a ukázala, jak OAD doplňuje CID pro spolehlivější identifikaci sloučenin.

Použitá metodika

Vzorek: komerční brambory byly vyvolány ke klíčení na světle, klíčky zamraženy a řezy tloušťky 10 µm připraveny kryomikrotomem a naneseny na ITO pokryté skleněné podložky.
Matrix: α‑cyano‑4‑hydroxycinnamová kyselina (CHCA) nanesená pomocí iMLayer na přibližnou tloušťku 0,7 µm.
MSI: obrazování v pozitivním režimu s volitelným prostorovým rozlišením (typicky 10 a 25 µm), měření rozsahu MS m/z ~270–1000 a MS/MS m/z ~100–1000. Optické pozorování kombinováno s CCD/optickým mikroskopem pro korelaci obrazu a MS distribuce.
MS/MS strategie: porovnání tradiční CID‑MS/MS (zachycující běžné fragmenty) s OAD‑MS/MS, kde atomární kyslík a hydroxylové radikály (O/OH•) generované z vodní páry radikálovým zdrojem selektivně způsobují radikálovou fragmentaci, která preferenčně láme C=C vazby a vazby v blízkosti heteroatomů, čímž poskytuje doplňující, často diagnostické fragmenty pro lokalizaci vazeb a odlišení strukturálních izomerů.

Použitá instrumentace

• Imaging Mass Microscope: iMScope QT (Shimadzu) pro MALDI‑MS obrazování.
• OAD‑TOF modul (RADICAL SOURCE I) integrovaný s TOF nebo LCMS platformou (použito v konfiguraci s LCMS‑9050) pro OAD‑MS/MS; radikály generovány mikrovlnným zdrojem z vodní páry.
• iMLayer systém pro homogenní nanášení CHCA matrixu.
• Softwarové nástroje: IMAGEREVEAL MS pro analýzu MSI dat a LabSolutions Insight Explore pro interpretaci MS/MS spekter a generování in silico fragmentů; databázové vyhledávání (např. ChemSpider) k návrhu kandidátních struktur.
• Pomůcky: kryomikrotom, ITO pokryté sklo, optický mikroskop/CCD kamera.

Hlavní výsledky a diskuse

• MSI lokalizovalo hlavní glykoalkaloidy solanin (m/z ~868.508 [M+H]+) a chakonin (m/z ~852.513 [M+H]+) s vysokou intenzitou v klíčcích a přilehlé pokožce brambor, což koresponduje s očekávanou obrannou akumulací těchto toxických glykoalkaloidů.
• Prostorové rozlišení 25 µm a 10 µm umožnilo rozlišení akumulace v makroskopických a mikroskopických strukturách tkáně.
• OAD‑MS/MS generovalo specifický diagnostický fragment při m/z 150.128 (vyhodnoceno jako C10H16N), který nebyl přítomen v nízké intenzitě v CID spektru. Tento fragment je charakteristický pro OAD a poskytl informaci o pozici vazeb/heteroatomových okolí, která výrazně zúžila množinu kandidátů získaných porovnáním CID dat s in silico fragmentací a databázovým vyhledáváním.
• Kombinované použití CID a OAD vedlo k jednoznačnému přiřazení solaninu ze skupiny strukturálně podobných sloučenin (např. solamargin, spirosol‑analogy), čímž se prokázal přínos OAD při rozlišení izomerů a analogů, kde CID samo o sobě nestačí.

Přínosy a praktické využití metody

• OAD doplňuje klasické CID o radikálově řízené štěpení, které je výhodné pro určení polohy dvojných vazeb a vazeb v okolí heteroatomů — zvyšuje selektivitu identifikace zejména u složitých přírodních produktů.
• MSI poskytuje prostorovou mapu distribuce biologicky aktivních či toxických alkaloidů přímo v tkáňovém kontextu, což je cenné pro studie fyziologie rostlin, bezpečnost potravin i cílený screening biologicky aktivních látek.
• Integrovaný workflow (MSI → CID + OAD → softwarová interpretace) urychluje objev nových sloučenin a zvyšuje spolehlivost strukturálních přiřazení bez nutnosti čistých standardů v každém případě.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření OAD na další třídy přírodních produktů a integrace s LC‑MS(n) pro kombinaci separace a prostorové analýzy.
• Vývoj automatizované interpretace OAD + CID spekter s podporou strojového učení pro rychlejší a robustnější identifikaci derivátů a izomerů.
• Zvýšení prostorového rozlišení a kvantitativních schopností MSI (např. kvantitativní MALDI‑MSI) pro přesnější mapování koncentrací v tkáních.
• Aplikace v agronomii a bezpečnosti potravin (sledování toxinů), farmaceutickém screeningu a v ekologických studiích interakcí rostlin‑patogeny/herbivory.

Závěr

Kombinace iMScope QT pro MALDI‑MS imaging a OAD‑TOF pro radikálově řízené MS/MS představuje silný přístup pro prostorové a strukturální zkoumání rostlinných alkaloidů. OAD doplňuje CID o unikátní diagnostické fragmenty, které umožnily v prezentovaném případě přesnější identifikaci solaninu přímo z tkáňových řezů. Tento integrovaný přístup zvyšuje šance na objev a spolehlivé určení nových biologicky aktivních sloučenin a nachází uplatnění v širších oblastech analytické chemie, přírodovědného výzkumu a průmyslových aplikací.

Reference

• Takahashi H. et al. Analytical Chemistry. 2018;90(12):7230–7238.
• Takahashi H. et al. Mass Spectrometry. 2019; S0080.
• Uchino H. et al. Communications Chemistry. 2022;5:162.