Rapid and Simple Analysis of LNP-Encapsulated mRNA Using a Microchip Electrophoresis System

Rychlá a jednoduchá analýza mRNA enkapsulované v LNP pomocí Microchip Electrophoresis MultiNA II

Význam tématu

mRNA terapeutika a vakcíny se staly klíčovou skupinou biologických léčiv. Pro jejich bezpečnost, účinnost a stabilitu je nezbytné spolehlivé hodnocení kvality formulací, zejména mRNA enkapsulované v lipidových nanočásticích (LNP). Analytické metody musí umožnit rychlé určení integrity, velikosti a koncentrace mRNA bez zbytečně složité přípravy vzorků, aby podporovaly vývoj, kontrolu kvality i skladování mRNA produktů.

Cíle a přehled studie

Cílem prezentované aplikace bylo ověřit možnost rychlé a citlivé analýzy mRNA v LNP formulacích pomocí automatizovaného microchipového elektroforézního systému MultiNA II (MCE-301) bez nutnosti odstraňovat lipidy. Studie ukazuje pracovní postup, podmínky a srovnání výsledků pro vzorky ošetřené pouze zahřátím versus vzorky ošetřené surfaktantem (Triton X-100) plus zahřátí a porovnání s referenčním (modelovým) mRNA.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Systém provádí plně automatizovanou přípravu gelu, nanesení vzorku a akvizici dat; typická doba migrace ~100 s na vzorek, což umožňuje vysokou propustnost.
• Vzorky: mRNA enkapsulovaná v LNP, modelová mRNA a kontrolní roztoky (Triton X-100).
• Příprava vzorků dle doporučení (shoda s návrhem USP draft guidelines): smíšení 1:1 se součástí dodávaného RNA markeru, zahřátí 70 °C na 5 min a zchlazení na 4 °C na 5 min.
• Pro uvolnění mRNA z LNP bylo testováno ošetření pouze teplem a kombinace s 0,1 % Triton X-100 následovaná tepelnou denaturací.
• Kontrolní velikostní standard a fluorescenční značení použity pro detekci a odhad velikosti.

Instrumentace a spotřební materiál (výběr):

• Microchip Electrophoresis System MultiNA II (MCE-301, Shimadzu)
• RNA kit (P/N: 292-27913-91) pro MultiNA II
• Fluorescenční barvivo SYBR Green II (P/N: S-7564)
• Size standard RNA 6000 Ladder (P/N: AM7152) a THE RNA Storage Solution (P/N: AM7001)
• Surfaktant: Triton X-100 (použito v koncentraci 0,1 % pro permeabilizaci LNP)

Hlavní výsledky a diskuse

Výsledky elektroforézy ukázaly, že:

• Vzorky mRNA-LNP ošetřené pouze zahřátím vykazovaly minimální signál, což naznačuje, že samotné zahřátí nestačí k efektivnímu uvolnění mRNA z LNP.
• Přidání 0,1 % Triton X-100 následované tepelnou denaturací vedlo k jasně detekovatelnému špičkovému signálu mRNA, přibližně odpovídajícímu velikosti modelové mRNA.
• Neobjevily se výrazné špičky odpovídající krátkým fragmentům, což naznačuje, že v testovaných podmínkách nebyla prokázána významná degradace mRNA.
• Kontrola obsahující pouze 0,1 % Triton X-100 nevykazovala interferující špičky v oblasti mRNA, což potvrzuje, že surfaktant nezpůsobil artefakty v místě detekce mRNA.

Diskuse:
Automatizovaná microchipová elektroforéza umožnila rychlou a opakovatelnou analýzu integrity a velikosti mRNA v LNP bez nutnosti mechanického nebo chemického odstranění lipidů. Přítomnost surfaktantu byla klíčová pro uvolnění mRNA a dosažení měřitelného signálu, v souladu s návrhem postupů pro kontrolu kvality mRNA léčiv. Absence krátkých fragmentů v analyzovaných vzorcích naznačuje dobrou stabilitu mRNA v zkoumaných formulacích a ošetřeních.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda přináší několik praktických výhod:

• Rychlost: ~100 s migrace na vzorek umožňuje vysokou propustnost analýz pro vývoj i rutinní QC.
• Automatizace redukuje pracovní náročnost a variabilitu způsobenou manuální přípravou gelu a aplikací vzorku.
• Možnost analyzovat mRNA přímo v LNP po jednoduchém přidání surfaktantu a tepelné denaturaci, bez nutnosti extrakce lipidů, zkracuje čas a snižuje riziko ztráty materiálu.
• Citlivá fluorescenční detekce (SYBR Green II) umožňuje měření nízkých koncentrací mRNA, vhodné pro QC a výzkum.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje a aplikace této metodiky zahrnují:

• Další optimalizace protokolů uvolňování mRNA z různých typů LNP a jiných DDS pomocí různých surfaktantů či kombinací chemie/tepla.
• Integrace s kvantitativními přístupy a validovanými standardy pro robustní kvantitativní QC v regulačním prostředí.
• Rozšíření aplikace na další nukleové kyseliny (siRNA, oligonukleotidy) a multi‑parametrické analýzy stability během dlouhodobého skladování.
• Automatizace workflow v kombinaci s LIMS a vyšší propustností pro podpoření průmyslové výroby a kontroly kvality.

Závěr

MultiNA II představuje rychlý, citlivý a plně automatizovaný nástroj pro analýzu mRNA enkapsulované v LNP. Přidání 0,1 % Triton X-100 a následné zahřátí podle doporučeného protokolu umožňuje detekci intactní mRNA bez nutnosti lipidové extrakce. Metoda zjednodušuje hodnocení velikosti, integrity a relativní koncentrace mRNA a má přímé uplatnění v procesu vývoje a rutinní kontroly kvality mRNA terapeutik a vakcín.

Reference

• Analytical Procedures for Quality of mRNA Vaccines and Therapeutics, Draft Guidelines: 3rd Edition.
• Shimadzu Corporation. Microchip Electrophoresis System MultiNA II MCE-301, Application Note (First Edition: Mar. 2026).
• Acknowledgment: Data acquisition support and samples provided by AGC Inc.