Quality Assessment of Total RNA Using MultiNA Automated Analysis

Význam tématu

Kvalitní stanovení integrity celkové RNA je zásadní pro úspěch metod jako real-time PCR, konstrukce cDNA knihoven, sekvenování (Sanger i NGS) či Northern blottingu. Degradace RNA nebo kontaminace bílkovinami a chemickými činidly vede k chybám v analýze a nesprávným závěrům. Moderní mikrochipová elektroforéza nabízí automatizaci a objektivní hodnocení kvality pomocí kvantitativních parametrů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo demonstrovat použití systému MultiNA™ MCE-202 pro hodnocení kvality celkové RNA extrahované z ledviny potkana skladované při laboratorní teplotě po dobu 0, 1 a 2 týdnů. Studie porovnávala poměr dvou hlavních rRNA komponent (28S/18S) jako ukazatel integrity RNA v čase.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek: Rat Kidney Total RNA od Clontech, počáteční koncentrace 1 µg/µL ředěna na 50 ng/µL v TE pufru.

Postup přípravy:

• Vzorky skladovány při pokojové teplotě 0, 1 a 2 týdny.
• Před analýzou termální denaturace: 65 °C 5 min + 4 °C 5 min.
• Vzorky a RNA žebřík (RNA 6000 Ladder) promíchány v poměru 1:1 s markerem SYBR Green II.

Instrumentace a reagencie:

• MultiNA™ MCE-202 Microchip Electrophoresis System (Shimadzu)
• RNA kit (Shimadzu)
• SYBR Green II (Thermo)
• RNA 6000 Ladder (Thermo)
• Separace v makromolekulární kapiláře s formamidem a TE pufrem

Hlavní výsledky a diskuse

Systém MultiNA automaticky detekoval dvě hlavní špičky odpovídající 18S a 28S rRNA a vypočítal jejich poměr (28S/18S). Naměřené hodnoty byly:

• 0 týdnů: 2,70
• 1 týden: 1,84
• 2 týdny: 1,63

Ideální poměr 2,0 potvrzuje vysokou kvalitu čerstvého vzorku. S délkou skladování poměr postupně klesá, což indikuje postupnou degradaci RNA. Automatizovaná analýza zaručila objektivní a reprodukovatelné výsledky, odstraňující subjektivní hodnocení dle gelové elektroforézy.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizovaný systém výrazně snižuje pracovní náročnost oproti klasické denaturované agarózové gelové elektroforéze. Generované číselné výsledky lze snadno archivovat a používat pro validaci, QC/QA a vysokoprodukční stanice zpracovávající stovky vzorků měsíčně. Rychlost analýzy a minimalizace manipulace s gelovým prostředím zvyšují spolehlivost dat.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další integrace mikrofluidních systémů s online kvantifikací RNA a DNA, vývoj vícekanálových čipů pro simultánní analýzu různých typů nukleových kyselin a modularita pro multiplexní stanovení kvality vzorků. Rozšíření metodiky do mobilních laboratoří a polního nasazení umožní rychlou kontrolu integrity biologických vzorků mimo tradiční pracoviště.

Závěr

MultiNA™ MCE-202 prokázal schopnost plně automatizované, rychlé a objektivní analýzy celkové RNA. Numerické vyhodnocení poměru 28S/18S poskytuje spolehlivý indikátor integrity vzorku v čase. Metoda je vhodná pro vysokokapacitní laboratoře a aplikace vyžadující vysokou reprodukovatelnost výsledků.

Reference

V původním textu nejsou uvedeny žádné literární odkazy.