Rapid Analysis of Anticoagulants in Plasma Using LC-MS/MS

Význam tématu

V časově náročných farmakokinetických studiích a hromadných analytických rutinních vyšetřeních je klíčové dosáhnout vysokého průtoku vzorků bez ztráty analytické kvality. Měření koncentrací perorálních antikoagulancií v plazmě hraje důležitou roli při sledování terapeutických hladin, bezpečnosti a při výzkumu nových léčiv. Rychlé, robustní a validovatelné metody LC-MS/MS umožňují efektivní zpracování rozsáhlých souborů vzorků a zkracují dobu odezvy laboratoří, čímž přispívají k lepšímu rozhodování v klinické i farmaceutické praxi.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem prezentované aplikace bylo vyvinout a verifikovat ultra‑rychlou LC‑MS/MS metodu pro simultánní kvantifikaci osmi antikoagulancií v lidské plazmě (pět přímých perorálních antikoagulancií – DOAC/NOAC a tři dalších antikoagulanty včetně kumarinů). Metoda má minimalizovanou předúpravu (deproteinace), krátký analytický cyklus a použití stabilně značených interních standardů pro spolehlivou kvantifikaci. Důraz byl kladen na vysokou propustnost (čas včetně ekvilibrace 2,45 min) při zachování přesnosti a přesnosti měření odpovídající bioanalytickým kritériím.

Použitá metodika a instrumentace

• Instrumentace: Shimadzu Nexera X4 ultra‑high‑performance LC v kombinaci s triple kvadrupólovým hmotnostním spektrometrem LCMS‑8060RX (ESI, pozitivní ionizace, MRM režim).
• Kolona: Shim‑pack NovaCore C18‑HB, 50 × 2.1 mm, 1.7 µm, vyhřívaná na 50 °C.
• Objem injekce: 1 µL, systém s nízkým disperzním objemem.
• Mobilní fáze: A – 5 mmol/L ammoniumformiát + 0,1 % kyseliny formiové ve vodě; B – 5 mmol/L ammoniumformiát + 0,1 % kyseliny formiové v MeOH : voda (9:1).
• Program průtoku: 0,5 mL/min (0.00–1.50 min) → 0.8 mL/min (1.51–2.00 min) → 0.5 mL/min (2.01–2.45 min) se gradientem B 5 % → 98 % → 5 % (celkový cyklus 2,45 min včetně ekvilibrace).
• Smycí režim autosamplera: kombinované vnitřní a vnější rychlé oplachování jehly (SIL‑40C X4), dokončené v průběhu analytického cyklu pro omezení carry‑over.
• Přístup k MRM: jednotlivé přechody pro každou látku a odpovídající stabilně značené interní standardy (13C nebo 2H označení) byly použity pro kvantifikaci.
• Předspracování vzorku: jednoduchá deproteinizace – do 50 µL plazmy přidán interní standard (25 µL), přidání 350 µL acetonitrilu:methanolu (8:2), vortex 1 min, centrifugace 20 000 × g 12 min, přenesení 200 µL supernatantu do LC lahvičky.

Hlavní výsledky a diskuse

• Analytická doba: kompletní cyklus včetně ekvilibrace činil 2,45 min, což umožňuje velmi vysokou propustnost vzorků vhodnou pro farmakokinetické studie.
• Rozsahy kalibrace: pro většinu cílových látek 10–500 µg/L; pro acenokoumarol a warfarin širší rozsah 100–5000 µg/L (odpovídá jinému terapeutickému rozsahu kumarinů).
• Detekční parametry: lineární kalibrace s vysokými korelačními koeficienty (R² přibližně 0.999), vážení 1/C, bez nuceného průchodu nulou.
• Přesnost a preciznost: QC hladiny (LLOQ, nízká, střední, vysoká) vykázaly přesnost v rozmezí zhruba 96–108 % a CV obvykle pod 15 %, což splňuje obecné požadavky na bioanalytickou validaci.
• Carry‑over: díky rychlému vnitřnímu i vnějšímu oplachu jehly a efektivnímu vyplachování měřicí linky byl carry‑over minimalizován i při ultra‑rychlém cyklu.
• Přínos konstrukčních řešení Nexera X4: čtyři nezávisle ovládané písty s řízením tlaku a sníženým pulzováním zlepšují odezvu dodávky mobilní fáze a stabilitu retencí při rychlých gradientech.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká propustnost: výrazné zkrácení doby analýzy umožňuje zpracování velkého množství vzorků, což je klíčové v PK studiích a při monitoringu léčiv v klinické praxi.
• Jednoduchá předúprava: deproteinace bez dalších extrakcí snižuje časovou a pracovní zátěž laboratoře a minimalizuje ztráty analytů.
• Robustnost: použití stabilně značených interních standardů zajišťuje korekci matrice a laboratorních odchylek, vhodné pro rutinní analýzu i studie s přísnými požadavky na kvalitu dat.
• Omezení carry‑over: efektivní oplachovací režimy reduce riziko kontaminace mezi injekcemi, což je nezbytné při koncentracích s velkým rozpětím.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření panelu analyzovaných látek: začlenění dalších antikoagulancií, metabolitů a potenciálních interferentů pro komplexní terapeutický monitoring.
• Automatizace předúpravy a integrace do vysokopropustných workflow (robotika, 96‑well formáty) pro další zvýšení průtoku a reprodukovatelnosti.
• Optimalizace pro nižší spotřebu mobilních fází (microflow / nanoflow) za účelem snížení provozních nákladů při zachování rychlosti analýzy.
• Implementace do klinických laboratoří: validace podle regulatorních požadavků a adaptace na rutinní rutiny sledování pacientů užívajících antikoagulancia.
• Pokročilá datová analýza: použití chemometrie a strojového učení pro prediktivní vyhodnocení výsledků a identifikaci vzorců v rozsáhlých datech PK studií.

Závěr

Metoda založená na Nexera X4 LC a LCMS‑8060RX umožňuje rychlé, přesné a opakovatelné stanovení osmi antikoagulancií v lidské plazmě s minimální předúpravou vzorku. Díky konstrukčním vylepšením HPLC (nízké pulzace, rychlé dávkování, tool‑less fittings) a účinnému oplachu jehly je dosaženo vysoké propustnosti bez zvýšení rizika carry‑over. Výsledky validace ukazují shodu s bioanalytickými standardy přesnosti a preciznosti, což podporuje využití metody v PK studiích a vysoce propustných rutinních aplikacích.

Reference

1. Guideline on bioanalytical method validation and study sample analysis, Ministry of Health, Labor and Welfare, Japan, December 2024 / November (pokyny pro validaci bioanalytických metod).