High Molecular-Weight Polysaccharide Characterization by SEC-MALS Using GTxResolve™ 1000 and 2000 Å SEC Columns

Význam tématu

Polysacharidy s vysokou molární hmotností hrají klíčovou roli v potravinářství, kosmetice, farmaceutickém průmyslu a vývoji vakcín. Jejich distribuce molárních hmotností a konformace ovlivňuje fyzikálně-chemické vlastnosti, jako je viskozita, stabilita formulací nebo biologická aktivita. Přesná charakterizace těchto parametrů je zásadní pro kontrolu kvality, vývoj a výrobu produktů založených na polysacharidech.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo demonstrovat vysoké rozlišovací schopnosti a robustnost sloupců GTxResolve Premier (1000 Å a 2000 Å) spojených s technikou SEC-MALS pro analýzu vodou rozpustných polysacharidů s vysokou molární hmotností. Studie porovnává chromatografický výkon těchto sloupců s běžně používanými polymerními SEC kolónami a ukazuje, jak SEC-MALS dokáže odhalit nedokonalé separace a zároveň poskytuje absolutní molární hmotnosti a konformační informace.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky pullulanu (100, 400, 800 kDa) a dextranu (250 kDa) byly rozpuštěny v mobilní fázi (10 mM NaCl, 20 % acetonitril, 200 ppm natriumazid) při koncentraci 5 mg/ml. Analýzy proběhly při teplotě kolony 35 °C a teplotě vzorku 25 °C, průtok 1 ml/min.

• Kromatografický systém Arc Premier LC System s Quaternary Solvent Manager
• PDA detektor Premier 2998
• Fotometr DAWN MALS a online DLS modul WyattQELS
• Diferenciální refraktometr Optilab dRI
• Sloupce GTxResolve Premier SEC 2000 Å a 1000 Å (7.8 × 150 mm, 3 µm) zapojené v sérii
• Pro porovnání tři Shodex OHpak sloupce (LB-806, LB-805, LB-804)
• Software HPLC CONNECT 4 a ASTRA 8

Hlavní výsledky a diskuse

Analýzy na GTxResolve sekvencích přinesly vysoce opakovatelné chromatogramy, symetrické píky, hmotnostní návratnost 99 % a nízký šum MALS signálu. U pullulanu 100 kDa byla naměřena hmotnost Mw = 112 ± 0.1 kDa.
Porovnání s polymerními kolónami odhalilo snížení rozlišení, neideální eluci a náznaky interakcí, které se projevily odchylkami ve vypočtených molárních hmotnostech a charakteristickým „hook“ tvarem konformačních závislostí Rg na M. Online DLS potvrdilo ideální separaci na GTxResolve kolónách shodou hydrodynamických poloměrů u různých vzorků při stejném eluvním objemu, i když se lišily molární hmotnosti.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoké rozlišení pro velké vodorozpustné polysacharidy díky široké distribuci pórů
• Absolutní určení molární hmotnosti a konformace bez kalibračních modelů
• Diagnostika neideální SEC chování a odhalení interakcí se stacionární fází
• Zvýšená propustnost díky kratším a účinným kolónám
• Univerzální uplatnění od polysacharidů přes plazmidy až po vektorové a proteinové komplexy

Budoucí trendy a možnosti využití

Metoda SEC-MALS s GTxResolve kolónami se jeví jako perspektivní pro rozšiřování analýzy dalších biopolymerů, např. chitosanu, alginátu, hyaluronové kyseliny či modifikovaných polysacharidů. Očekává se integrace online viskometrie a multimodální detekce pro komplexní multiatributní kvantifikaci, stejně jako adaptace na mikroproudové chromatografické formáty pro vyšší propustnost.

Závěr

Kombinace sloupců GTxResolve Premier a techniky SEC-MALS poskytuje spolehlivou a vysoce rozlišovací platformu pro charakterizaci vysokomolekulárních polysacharidů. Metoda překonává tradiční polymerní SEC kolony v přesnosti a citlivosti, umožňuje detailní stanovení molárních hmotnostních distribucí, konformace a odhalování neideálních jevů.

Reference

1. Wang Z et al. Regulation Strategy, Bioactivity, and Physical Property of Plant and Microbial Polysaccharides Based on Molecular Weight. Int J Biol Macromol. 2023;244:125360.
2. Howard JG et al. The Influence of Molecular Weight on the Immunogenicity, Tolerogenicity and Antibody-Neutralizing Activity of Type III Pneumococcal Polysaccharide. Immunology. 1971;21(3):535–546.
3. Münster L et al. Oxidized Polysaccharides for Anticancer-Drug Delivery: What Is the Role of Structure? Carbohydr Polym. 2021;257:117562.