Optimized Method Conditions for mRNA Characterization by SEC-MALS With GTxResolve™ Premier SEC 1000 Å 3 μm Columns

Význam tématu

Charakterizace mRNA pomocí SEC-MALS umožňuje přesné stanovení klíčových fyzikálně-chemických parametrů terapeutických mRNA látek, jako je molární hmotnost, velikost, agregace a konformace. Tyto údaje jsou zásadní pro ověření kvality, bezpečnosti a účinnosti moderních genových terapií a vakcín, zejména v kontextu rychle se rozvíjejících technologií mRNA.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo optimalizovat chromatografické podmínky pro SEC-MALS s použitím GTxResolve Premier SEC 1000 Å 3 µm kolony tak, aby se dosáhlo selektivní separace a přesného kvantitativního určení molární hmotnosti, velikosti a procenta agregátů u různých mRNA konstrukcí. Studie využila systematický přístup pomocí Design of Experiments (DoE) pro identifikaci nejvlivnějších parametrů mobilní fáze.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda vycházela ze SEC-MALS při konstantním průtoku a teplotě kolony. Mobilní fáze byla 50 mM Tris-HCl pH 7,5 s 250 mM NH4Cl. Teplota kolony 40–50 °C a průtok 0,30 mL/min zajistily optimální separaci. Pro sběr dat byla použita kombinace UV detektoru (260 a 280 nm), multiúhlového světelného rozptylu (MALS) a refraktometrického (dRI) detektoru. Data se zpracovávala pomocí softwaru ASTRA 8 a HPLC CONNECT.

Použitá instrumentace

• HPLC systém Arc Premier s Quaternary Solvent Manager a Flow Through Needle Sample Manager
• GTxResolve Premier SEC 1000 Å, 3 µm kolony (4,6×150 a 7,8×300 mm)
• Wyatt DAWN MALS detektor s integrovaným DLS modulem (WyattQELS)
• Optilab dRI detektor
• Arc Premier W2998 PDA detektor
• Software HPLC CONNECT a ASTRA 8

Hlavní výsledky a diskuse

DoE identifikovalo tři klíčové faktory: povahu iontů aditiva (ammonium chloride preferován), celkovou iontovou sílu (optimálně 200–250 mM) a teplotu kolony (40–50 °C). Organická aditiva neměla významný dopad a hořečnaté soli snižovaly recovery. Optimalizované podmínky zlepšily rozlišení monomeru, dimeru a trimeru Cas9 mRNA a snížily šum MALS.
Separace dsDNA žebříčku prokázala spolehlivé rozlišení 17 komponent, přičemž naměřené molární hmotnosti odpovídaly teoretickým hodnotám (lineární regrese: sklon 1,03). Analýzy mRNA ukázaly, že „nelečené“ vzorky obsahují až 33 % agregátů, které lze snížit na ~2 % krátkým tepelným zpracováním a re-annealingem. Pomocí MALS bylo možné jednoznačně přiřadit každou špičku a určit konformaci na základě poměru Rg/Rh.

Přínosy a praktické využití metody

• Absolutní kvantifikace molární hmotnosti bez kalibračních křivek
• Detekce a kvantifikace agregátů i fragmentů mRNA
• Stanovení UV extinkčního koeficientu pro dávkování a QC
• Hodnocení konformace biomolekul pomocí Rg vs. M analýzy

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace dalších detektorů (např. MS) pro rozšířenou charakterizaci
• Automatizace DoE workflows a online optimalizace metod
• Vývoj sloučenin a paměťových povrchů pro další snížení nespecifických interakcí
• Adaptace metody na nové mRNA konstrukty a dlouhé RNA segmenty

Závěr

Optimalizované podmínky SEC-MALS s GTxResolve Premier SEC 1000 Å 3 µm kolony poskytují robustní, reprodukovatelné a vysokopřesné analýzy fyzikálně-chemických vlastností mRNA. Metoda umožňuje komplexní profilování kvality mRNA klinického významu a podporuje vývoj a kontrolu nových genových terapií.

Reference

1. Camacho K. J. et al. Bridged Ethylene Polyethylene Oxide Surfaces To Improve Packing Materials For Widepore Size Exclusion Chromatography. Journal of Separation Science. 47(20), 2024.
2. Wang P. et al. SEC-MALS Method for Characterizing mRNA Biophysical Attributes. Wyatt Technology Corporation, AN1616, 2023.
3. USP Draft Guidelines: Analytical Procedures for Quality of mRNA Vaccines and Therapeutics. United States Pharmacopeia, 2023.
4. Fekete S., Lauber M. A. A Systematic Quick Method Development Approach to Optimize Protein Size Exclusion Chromatography. Waters application note 720007790, 2022.
5. Koetsier G., Cantor E. A Practical Guide to Analyzing Nucleic Acid Concentration and Purity. New England Biolabs, 2019.