High Efficiency Protein A Affinity Columns for the LC-MS and 2D LC-MS Analysis of mAb and msAb

Význam tématu

Analýza monoklonálních (mAb) a multispecifických (msAb) protilátek je klíčová pro kontrolu kvality i výzkum biologických léčiv. Vysoce účinné Protein A affinity kolony umožňují přímou purifikaci a charakterizaci protilátek z klarifikovaných buněčných kultur bez náročné přípravy vzorku. Kombinace s LC-MS a 2D LC-MS metodikami přináší rychlé a citlivé hodnocení intact molekul, subjednotek i glykoformních variant.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo vyvinout a otestovat novou 2.1×20 mm Protein A kolonu s 3,5 µm částicemi a provozním tlakem až 450 bar pro:

• jednodimenzionální off-line a on-line LC-MS analýzu intact mAb/msAb
• dvoudimenzionální heart-cutting 2D LC-MS pro detailní subunit analýzu a glykoformní rozlišení
• vyhodnocení metody na modelových protilátkách (amivantamab, adalimumab, NISTmAb) v pufrech i v buněčném médiu

Použitá metodika a instrumentace

V jednorozměrné (1D) intact analýze byla kolona ProA propojena s SEC kolonkou pro rozlišení monomeru, HMW agregátů a fragmentů před QTof MS. Subunit analýza používala redukci disulfidových vazeb DTT na pastišti, následnou RP separaci jednotlivých řetězců a HRMS detekci. Heart-cutting 2D LC-MS režim uchopil frakce z první dimenze, desalting či redukci na pasťovacím sloupci a eluci do druhé dimenze pro detailní chromatografii.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC systém (Waters)
• BioResolve Protein A Affinity Column, MaxPeak Premier, 3.5 µm, 2.1×20 mm
• BioResolve mAb RP Polyphenyl kolona, 2.7 µm, 450 Å
• ACQUITY Premier Protein SEC Column, 1.7 µm, 250 Å, 4.6×150 mm
• Xevo G2-XS a G3 QTof Mass Spectrometer (Waters)
• waters_connect Software pro řízení a zpracování dat

Hlavní výsledky a diskuse

Ve všech režimech byla protilátka z buň. média analyzována se stejnou intenzitou a chromatografickým rozlišením jako z pufru. 2D LC-MS subunit analýza přinesla jasné oddělení těžkého (HC) a lehkého (LC) řetězce i mutovaných variant (Δ m 3,05 Da). Intact SEC-MS režim správně kvantifikoval monomer, agregáty i fragmenty a potvrdil hmotnostní varianty glykoform. High-throughput ProA-MS metoda pro NISTmAb vykázala lineární odezvy (R²>0,9999) a citlivost pro glykoformní varianty na stopové úrovni.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje přímou purifikaci, separaci a charakterizaci mAb/msAb z komplexního matrice v jednom běhu. To zkracuje dobu analýzy a eliminuje offline přípravu vzorků. Výsledky jsou vhodné pro QC během výroby, screening mutací či glykoformního profilu i pro procesní monitoring v reálném čase.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další miniaturizace a zvýšení rychlosti kolonek, rozšíření na jiné affinity ligandy (Protein G, L), integrace s automatizovanými procesními kontrolními systémy a využití strojového učení pro optimalizaci separačních podmínek a rychlé vyhodnocení dat. Potenciálem je on-line sledování kritických parametrů výroby biologik.

Závěr

Použití high-efficiency Protein A affinity kolony v kombinaci s LC-MS a 2D LC-MS režimy nabízí robustní, citlivý a vysoce specifický přístup k analýze intact i subunit variant mAb a msAb přímo z buněčných kultur. Metoda podporuje rychlé QC rozhodování a detailní charakterizaci strukturálních i posttranslačních modifikací.

Reference

Žádné specifické literární citace uvedeny.