High-Resolution Separations of Single and Double-Stranded Nucleic Acids Using Strong Anion-Exchange Chromatography

Vysoce rozlišené separace jednovláknových a dvouvláknových nukleových kyselin pomocí silné aniontové výměnné chromatografie

Význam tématu

Spolehlivá separace nukleových kyselin je zásadní pro vývoj genové terapie a vakcín. Precizní charakterizace velikostně různorodých DNA fragmentů zajišťuje kvalitu léčivých přípravků a splnění regulatorních požadavků. Tradiční gelové metody nabízejí omezenou průchodnost, kvantifikaci a automatizaci, kterou silná aniontová výměnná chromatografie (AEX) dokáže překonat.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo optimalizovat AEX metodu pro separaci ssDNA v rozsahu 10 až 100 nukleotidů a dsDNA od 100 bp do 15 000 bp. Studie využívá vodou filtrovaný Tris pufr pH 9 s 5 procenty urey a gradaci NaCl pro potlačení sekundárních struktur a zvýšení selektivity na Waters Protein-Pak Hi-Res Q kolonu.

Použitá metodika

Metoda využívá přípravu nukleových kyselin ve vhodném objemu nuclease-free vody, injekční objemy 1 až 2 µl a průtok 0,5 ml/min. Gradient NaCl byl nastaven tak, aby malé fragmenty elutovaly při nižší koncentraci chloridu, zatímco větší fragmenty vyžadovaly vyšší koncentrace pro desorpci z fáze.

Použitá instrumentace

• ACQUITY Premier LC System s Binary Solvent Manager
• Flow-Through Needle Sample Manager (SM-FTN)
• Column Manager-A
• ACQUITY Premier eLambda PDA detektor s titanovou flow cell
• Protein-Pak Hi-Res Q Kolona, 5 µm, 4,6 × 100 mm
• Empower 3.9.x pro řízení a akvizici dat

Hlavní výsledky a diskuse

Ověření ssDNA žebříčků (10–60 mer, 20–100 mer) ukázalo jasné rozlišení jednotlivých políček s ostrými symetrickými píky a hlubokými údolími. U dsDNA žebříčku (100–15 000 bp) byly dobře odděleny všechny fragmenty kromě 300/400 bp a 1 000/1 500 bp. Metoda dosahuje vysoké návratnosti (>105 %) a nízkého carryover, což potvrzují prázdné injekce bez zbytkové absorbance.

Přínosy a praktické využití metody

• Vyšší rozlišení a reprodukovatelnost než gelové techniky
• Rychlá implementace a snadná automatizace v bioprodukčních postupech
• Možnost sběru jednotlivých frakcí pro další analýzy
• Robustní potlačení sekundárních struktur díky použití urey

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření AEX metod pro analýzu dalších typů nukleových kyselin, včetně RNA a modifikovaných nukleotidů. Integrace s vysokopropustnými systémy a on-line frakční sběr zvýší efektivitu analýz v rozvíjejících se terapiích genové editace.

Závěr

Optimalizovaná silná aniontová výměnná chromatografie na Waters Protein-Pak Hi-Res Q kolonu s přídavkem urey a gradací NaCl nabízí spolehlivou a škálovatelnou alternativu k gelovým technikám pro rozlišení nukleových kyselin od 10 nukleotidů do 15 000 párů bází. Metoda poskytuje vysoké rozlišení, plnou návratnost analyzovaných vzorků a minimální carryover, což podporuje její nasazení v biotechnologickém a farmaceutickém sektoru.

Reference

• Sun X et al Signal Transduction and Targeted Therapy 2024;9(1):1–31
• FDA Cellular & Gene Therapy Guidances 2025
• Yamakawa H, Higashino K ich, Ohara O Anal Biochem 1996;240(2):242–250
• Finny AS et al Waters Application Note 2025;720008847