Separation and Size Assessment of dsDNA Fragments by Anion-Exchange Chromatography (AEX)

Význam tématu

Analýza a separace dvojřetězcové DNA (dsDNA) je klíčová v oblasti buněčné a genové terapie či vývoje vakcín. Prokazování přítomnosti a identity plasmidové DNA je zásadní pro kontrolu počátečního materiálu, meziproduktů i finálního léčiva.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této aplikace bylo demonstrovat, že aniontově-výměnná chromatografie (AEX) na koloni Waters Protein-Pak Hi Res Q dokáže separovat 1 kb Plus DNA Ladder v rozsahu 0,1–10 kbp a umožňuje odhad velikosti fragmentů plasmidů po restrikční digescích.

Použitá metodika

Pro separaci dsDNA fragmentů byly navrženy následující podmínky:

• Mobilní fáze: 20 mM Tris pH 7,4 (Tris-HCl/Tris) s postupným zvyšováním koncentrace TMAC (0–2400 mM).
• Gradient: počáteční vazba při 0 mM NaCl ekvivalentu, rychlé navýšení na 1620 mM (2 min), lineární růst na 1780 mM (20 min), stripping na 2400 mM (2 min) a následná reekvilibrace.
• Vzorky: 1 kb Plus DNA Ladder (New England Biolabs) a pBR322 plasmid po BstNI digescích.

Použitá instrumentace

Chromatograf ACQUITY UPLC H-Class Bio System s detektorem TUV (260 nm), kolona Protein-Pak Hi Res Q (4,6 × 100 mm, 5 µm), teplota kolony 30 °C, teplota vzorku 10 °C, objem injekce 0,3 mL, průtok 0,4 mL/min.

Hlavní výsledky a diskuse

Separace DNA žebříku na AEX koloně byla srovnatelná s agarózovou gelovou elektroforézou. Retenční časy fragmentů korelovaly s logaritmem velikosti (R2 = 0,981). Většina fragmentů plasmidu pBR322 byla určena s chybou <11 %. Použití TMAC potlačilo vliv poměru A-T/G-C na retenční chování díky vyrovnání teplot tání.

Přínosy a praktické využití metody

AEX nabízí vyšší propustnost, možnost automatizace, kvantitativní výstupy a minimalizaci objemu vzorku oproti gelové elektroforéze. Metoda je vhodná pro QC plasmidů v biotechnologickém a farmaceutickém průmyslu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření využití AEX na stanovení prázdných a plných kapsid adeno-asociovaných virů, kvantifikaci izoform plasmidů či vazebnou charakterizaci nukleových kyselin. Kombinace s MALS pro přesné určování molekulových hmotností a vývoj modulárních gradientních protokolů.

Závěr

Aniontově-výměnná chromatografie na Waters Protein-Pak Hi Res Q koloně s TMAC efektivně separuje dsDNA fragmenty o velikosti 0,1–10 kbp a umožňuje přesné odhadnutí jejich velikosti. Metoda je robustní, reprodukovatelná a vhodná pro automatizované QC aplikace v oblasti genové a buněčné terapie.

Reference

1. US FDA. Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy INDs; Guidance for Industry; CBER, 2020.
2. Kato Y., Sasaki M., Hashimoto T. Separation of DNA Restriction Fragments by High-Performance Ion Exchange Chromatography. J. Chromatogr. 1983, 265, 342–346.
3. Kato Y., Yamasaki Y., Onaka A., Kitamura T., Hashimoto T. Separation of DNA Restriction Fragments by Non-Porous Ion Exchanger. J. Chromatogr. 1989, 478, 264–268.
4. Muller W. Fractionation of DNA Restriction Fragments with Ion-Exchangers for HPLC. Eur. J. Biochem. 1986, 155, 203–212.
5. Shapiro J.T., Stannard B.S., Felsenfeld G. Binding of Small Cations to DNA: Nucleotide Specificity. Biochemistry 1969, 8(8), 3233–3241.
6. Melchior W.B. Jr., Von Hippel P.H. Alteration of the Relative Stability of dA-dT and dG-dC Base Pairs. PNAS 1973, 70(2), 298–302.
7. Yang H., Koza S., Chen W. Anion-Exchange Chromatography for Determining Empty and Full Capsid Contents in AAV. Waters Appl. Note 720006825, 2021.
8. Yang H., Koza S., Chen W. Plasmid Isoform Separation and Quantification by AEX. Waters Appl. Note 720007207, 2021.