Mining Drug Metabolite Data Using waters_connect™ LC-MS Toolkit, Mass Fragment and Tandem Quadrupole LCMS/ MS

Význam tématu

Identifikace a potvrzení struktury metabolitů léků je klíčová pro bezpečnostní a farmakokinetické studie v raných fázích vývoje léčiv. Rychlá a spolehlivá metodika usnadňuje srovnání vzorků napříč dávkováním, druhy zvířat či pohlaví, čímž zkracuje čas potřebný pro rozhodování o dalším postupu výzkumu.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat použití LC-MS Toolkit a MassFragment v rámci waters_connect Quantitation Software ve spojení s tandemovou kvadrupólovou LC-MS/MS k rychlému porovnání vzorků a potvrzení identity tří isobarických desmetyl-O-glukuronidových metabolitů methapyrilenu vzniklých po perorálním podání samcům potkanů.

Použitá instrumentace

• UPLC systém ACQUITY Premier
• Kolona CORTECS C18 2,1×50 mm, částice 2,7 μm
• Tandemový kvadrupólový hmotnostní spektrometr Xevo TQ Absolute XR
• Software waters_connect for Quantitation včetně LC-MS Toolkit a MassFragment

Použitá metodika

Vzorky moči po opakované 5denní aplikaci methapyrilenu (50 a 150 mg/kg/den) byly sráženy acetonitrilem, centrifugovány a ředěny 1:10. Analýza probíhala na UPLC v režimu reverzní fáze s gradientem 5–40 % organické fáze během 10 minut při průtoku 600 μl/min. Detekce probíhala v pozitivním režimu ESI s režimem produktového iontového skenování pro prekurzorová m/z 262 a 440 v rozsahu 50–550 m/z. Data byly zpracovány v LC-MS Toolkit, fragmentace potvrzena v MassFragment.

Hlavní výsledky a diskuse

Extrahované chromatogramy m/z 440 ukázaly tři vrcholy při retenčních časech 0,63; 1,76 a 2,07 min. Porovnání MS2 spekter odhalilo rozdíly ve vzorcích fragmentů, které indikují různá místa glukuronidace:

• tR 0,63 min: fragmenty m/z 97, 113, 151 – glukuronidace v oblasti thiophenového jádra
• tR 1,76 min: fragmenty m/z 97, 137, 166, 233 – modifikace na alifatickém řetězci mezi pyridinovým jádrem
• tR 2,07 min: fragmenty m/z 97, 121, 217 – glukuronidace na pyridinovém kruhu

MassFragment umožnil automatické párování pozorovaných fragmentů s in silico generovaným štěpením, což potvrdilo lokalizaci míst metabolismu.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí rychlé srovnání chromatogramů a spekter mezi vzorky, usnadňuje potvrzení identity isobarických metabolitů a zvyšuje důvěru ve strukturní přiřazení bez nutnosti rozsáhlé manuální interpretace.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření integrace s automatizovanou a umělou inteligencí podpořenou interpretací spekter, podpora rozsáhlých studií multi-omických dat a další rozvoj cloudových platforem pro sdílení a spolupráci v reálném čase.

Závěr

Použití LC-MS Toolkit a MassFragment v prostředí waters_connect spolu s tandemovou kvadrupólovou LC-MS/MS umožňuje efektivní potvrzení míst metabolismu a usnadňuje profilování metabolitů v časově náročných farmakologických studiích.

Reference

1. Dear GJ, Plumb RS, Sweatman BC, Ayrton J, Lindon JC, Nicholson JK, Ismail IM. Mass Directed Peak Selection, an Efficient Method of Drug Metabolite Identification Using Directly Coupled Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 2000;748(1):281–93.
2. Molloy BJ, King A, Mullin LG, Gethings LA, Riley R, Plumb RS, Wilson ID. Rapid Determination of the Pharmacokinetics and Metabolic Fate of Gefitinib in the Mouse Using a Combination of UPLC/MS/MS, UPLC/QToF/MS, and ion mobility (IM)-enabled UPLC/QToF/MS. Xenobiotica. 2021;51(4):434–446. doi:10.1080/00498254.2020.1859643.
3. Plumb RS, Lai SK, Gethings LA, Trengove R, Hancock P, Wilson ID. An Investigation of the Plasma and Urinary Metabolite Profiles of the Hepatotoxin Methapyrilene in the Male Wistar Rat. J Pharm Biomed Anal. 2025;264:116976. doi:10.1016/j.jpba.2025.116976.