One Pot, Mildly Acidic Digestion Protocols for Peptide Mapping Using Lys-C and RapiZyme™ Trypsin

Význam tématu

Peptidové mapování monoklonálních protilátek (mAbs) je zásadní metodou pro potvrzení primární struktury a stanovení kritických kvalitativních atributů. Tradiční příprava vzorku často vyvolává uměle indukované modifikace, jako je deamidace a oxidace, které komplikují interpretaci výsledků. Proto je vývoj šetrnějších a efektivnějších postupů přípravy nezbytný pro spolehlivou charakterizaci bioterapeutik.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této studie bylo ověřit jednoprostorový (one-pot) protokol enzymatického rozštěpení protilátky NISTmAb kombinací RapiZyme Trypsinu a Lys-C v mírně kyselém prostředí. Hlavními parametry byly pH (5,5; 6,0; 6,5), doba inkubace (0,5; 1; 3 h) a srovnání s benchmarkem při pH 7,5. Hodnoceny byly míra dokončenosti štěpení, výskyt nechtěných modifikací a odolnost enzymů vůči autolýze.

Použitá instrumentace

• RapiZyme Trypsin, MS-grade (Waters)
• Lys-C endopeptidáza, MS-grade (Marvelgent Biosciences)
• ULPC systém ACQUITY Premier UPLC (Waters)
• Kolona ACQUITY Premier Peptide CSH C18, 1,7 µm, 2,1×100 mm
• Detektor Xevo G2-XS QTof s ESI+ režimem
• Software waters_connect pro správu dat

Použitá metodika

Vzorek NISTmAb byl denaturován a redukován v 5 M GuHCl s 3 mM TCEP, alkylován 7 mM IAM, poté ředěn desetinásobně histidinovým pufrem (pH 5,5/6,0/6,5). K roztoku se přidaly enzymy při poměrech enzym:protein 1:5 pro Trypsin a 1:50 pro Lys-C. Inkubace probíhala při 37 °C po 0,5–3 h, reakce byla ukončena 1 % kyselinou formiovou. Roztoky se nepotřebovaly desalting, což zjednodušilo workflow. Následovala chromatografie na CSH C18 kolóně a MS analýza v rozmezí 100–4000 m/z.

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza ukázala, že se zvyšujícími se hodnotami pH a prodlužující dobou digesce roste podíl očekávaných štěpných fragmentů a klesá počet neúplných štěpení. Kombinace Lys-C s Trypsinem významně zlepšila dokončenost digesce při nízkém pH oproti použití Trypsinu samostatně. Metodou indukovaná deamidace (peptid PENNYK) a oxidace (peptid MISR) byly pod úrovní benchmarku při pH 7,5. Sledování autolytických peptidů prokázalo vysokou odolnost RapiZyme Trypsinu vůči autolýze i v kombinaci s Lys-C.

Přínosy a praktické využití metody

• Zjednodušená one-pot příprava bez potřeby desaltingu
• Snížení metodou indukovaných modifikací
• Možnost optimalizace pH a doby inkubace podle požadované úrovně digesce
• Vysoká odolnost RapiZyme Trypsinu vůči autolýze

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření protokolu pro cílené mapování vybraných modifikací, integrace do plně automatizovaných systémů a aplikace na další bioterapeutické proteiny. Dalším krokem může být validace metody v rámci regulovaných laboratoří a porovnání s alternativními proteázami či pufry.

Závěr

One-pot mírně kyselá digesce za použití RapiZyme Trypsinu a Lys-C představuje robustní a efektivní přístup k peptidovému mapování mAbs. Protokol zkracuje přípravu vzorku, minimalizuje metodou vyvolané modifikace a zajišťuje vysokou úroveň digesce bez ztráty integrity analytů.

Reference

1. Chelius D, Rehder DS, Bondarenko PV. Identification and Characterization of Deamidation Sites in the Conserved Regions of Human Immunoglobulin Gamma Antibodies. Anal Chem. 2005;77:6004.
2. Cao M et al. An Automated and Qualified Platform Method for Site-Specific Succinimide and Deamidation Quantitation Using Low-pH Peptide Mapping. J Pharm Sci. 2019;108:3540–3549.
3. Ippoliti S, Zampa N, Yu YQ, Lauber MA. Versatile and Rapid Digestion Protocols for Biopharmaceutical Characterization Using RapiZyme™ Trypsin. Waters Application Note 720007840EN. 2023.
4. Hanna CM, Danaceau JP, Koza SM, Shiner S, Trudeau M. Quick and Robust Sample Preparation for Tryptic Peptide Mapping With the PeptideWorks™ Kit. Waters Application Note 720008019EN. 2023.