Enhanced Host Cell Protein Identification and Quantitation with Multi-Reflecting ToF LC-MS

Význam tématu

Analýza a kvantifikace hostitelských buněčných proteinů (HCP) je klíčová součást vývoje a kontroly kvality bioterapeutik. Tyto nízkoabundantní endogenní proteiny mohou negativně ovlivnit účinnost, stabilitu a bezpečnost léčiv, a proto je nezbytné spolehlivě sledovat jejich odstranění během výrobního procesu.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ověřit schopnosti nového multi-reflektivního TOF Q-ToF spektrometru (Xevo™ MRT) v rámci LC-MSE datově nezávislé akvizice a Hi3 kvantifikace, na modelovém vzorku referenčního monoklonálního protilátkového materiálu NIST mAb RM 8671. Klíčovým výstupem bylo detekovat a kvantifikovat jednotlivé HCP v rozsahu od stovek ppm až po jednotky ppb.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorku byl použit nenavíravý tryptický štěpný protokol preferenčně rozkládající HCP a útlum terapeutické protilátky. Po redukci DTT a přidání interních standardů (BSA, phosphorylase B, ADH, enolasa) následovala LC-MSE analýza na systému Waters ACQUITY™ Premier UPLC (CSH C18 2,1×150 mm, 1,7 µm, 60 °C) spojeném s masovým spektrometrem Waters Xevo MRT v módu MSE (50–2000 m/z, pozitivní polarita, 2 Hz, kolizní energie 20–45 V). Data byla zpracována v ProteinLynx Global Server 3.0.3 s databází UniProt Mus doplněnou o sekvence NIST mAb a standardů.

Hlavní výsledky a diskuse

Detekováno bylo 101 unikátních HCP při celkovém rozsahu dynamiky přes 4 řády (128 ppm až 12 ppb). Z nich 58 proteinů bylo kvantifikováno pod 1 ppm. Díky MSE akvizici bez selektivního výběru prekurzorů byla zajištěna vysoká pokrytí sekvencí i fragmentační data pro nízkoabundantní proteiny. Příklady, jako poly(rc)-binding protein 2, ukázaly sledování až 12 unikátních peptidů a pokrytí 59 % sekvence při úrovni 16 ppb. Relativní kvantifikace vykázala silnou korelaci s předchozími studiemi (Huang et al.), přičemž Xevo MRT zajistil vyšší počet identifikovaných peptidů pro většinu HCP.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšená citlivost a rozšířený dynamický rozsah umožňují včasnou detekci nízkoabundantních HCP.
• Detailní kvantifikace jednotlivých proteinů podporuje cílené strategie purifikace a hodnocení rizik ve výrobě bioterapeutik.
• Metoda HRMS funguje jako ortogonální přístup k ELISA, nevyžaduje protilátkové činidla a zkracuje vývoj HCP testů.
• Jednoinjekční workflow zkracuje dobu analýzy a zvyšuje propustnost laboratoře.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj datově nezávislých akvizičních režimů, automatizovaných postupů vzorkování a integrace umělé inteligence pro rychlejší a spolehlivější analýzu HCP. Rozšíření metod do multi-omics přístupů umožní komplexnější charakterizaci procesních nečistot a lepší predikci interakcí s léčivými proteiny.

Závěr

Workflow kombinující nenáročnou přípravu vzorku, LC-MSE a Hi3 kvantifikaci na masovém spektrometru Xevo MRT nabízí robustní a citlivý nástroj pro objevování a kvantifikaci HCP v rozsahu od stovek ppm po jednotky ppb. Metoda podporuje rychlá, vysoce spolehlivá rozhodnutí při vývoji a výrobě bioterapeutik.

Reference

1. Doneanu C.E. et al. Analytical Chemistry 2015;87(20):10283–10291.
2. Huang L. et al. Analytical Chemistry 2017;89(10):5436–5444.
3. Claydon A. et al. Thermo Fisher Scientific Application Note AN73412, 2020.
4. Wang H., Hanash S. Methods 2015;81:34–40.