Development of Sensitive and Simultaneous Determination Method for Thirty-Seven D/L-Amino Acids by Automatic Pre-column Derivatization with Chiral Thiol Using UHPLC

Význam tématu

V posledních letech roste zájem o enantiomerní analýzu aminokyselin vzhledem k jejich významu v oblasti senzorických vlastností potravin, konzervace, metabolismu a potenciálních onemocnění. Rozlišení D- a L-aminokyselin přináší hlubší vhled do biochemických procesů a umožňuje kvalitativní i kvantitativní hodnocení potravinářských a biologických vzorků.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout citlivou a zrychlenou metodu pro simultánní stanovení 37 proteinogenních D/L-aminokyselin (kromě prolinu) využitím automatické prekolonové derivatizace chirogenním thiolovým činidlem a kapalinové chromatografie s extrémně vysokým tlakem (UHPLC). Studium se zaměřilo na optimalizaci derivatizační reakce, chromatografických podmínek i automatizace přípravy mobilní fáze.

Použitá metodika a instrumentace

Sample preparation

• Vzorky: dvě piva (ales, lagery), saké, červené a bílé víno; ředění HCl a filtrace 0,2 μm PTFE.
• Derivatizace: o-ftalaldehyd (OPA) s N-isobutyrylovou L-cysteinou (NIBC), optimálně OPA 2 mg/mL + NIBC 1 mg/mL, čekací doba 1,5 min v autosampleru.

Chromatografické podmínky

• UHPLC systém: Shimadzu Nexera X3 s detektorem fluorescenčním (Ex 338 nm, Em 455 nm).
• Kolona: C18, 150×2,1 mm, 2 μm, teplota 20 °C, průtok 0,22 mL/min.
• Mobilní fáze: A – 10 mmol/L fosfátový pufr (pH 6,9), B – acetonitril/methanol (15:85), gradient eluce ca. 66 min.
• Automatická příprava mobilní fáze a prekolonová derivatizace zajištěna integrovanými funkcemi pump, autosampleru a mixéru.

Hlavní výsledky a diskuse

• Optimalizace derivatizace: maximální fluorescenční signál při OPA 2 mg/mL a NIBC 1 mg/mL; reakční doba minimálně 1,5 min.
• Separace všech 37 diastereomerů D/L-aminokyselin v jediné analýze za 66 minut (oproti původním 120 min).
• Validační parametry: opakovatelnost (RSD ≤ 1,6 %), lineární rozsah (r2 ≥ 0,999) a recovery 84,9–108,6 %.
• Analýza reálných vzorků: podíl D-isomerů v pivech, vínech a saké maximálně 6 %; PCA umožnila rozlišení typů alkoholických nápojů podle vzorců aminokyselin.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlé a citlivé stanovení enantiomerů bez nutnosti hmotnostní spektrometrie.
• Simplifikovaná UHPLC sestava s automatizovanou derivatizací vhodná pro rutinní QA/QC a potravinářský výzkum.
• Možnost profilingu různých potravinářských a biologických vzorků včetně fermentovaných nápojů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace vysokopropustných (high-throughput) dělených systémů pro větší objem vzorků.
• Rozšíření aplikace na další chirální biomolekuly (peptidy, malé organické sloučeniny).
• Napojení na on-line vzorkovací a mikrofluidní platformy pro miniaturizaci a úplnou automatizaci.
• Uplatnění v metabolomice a biomedicínském výzkumu jako rychlý screening chirálních metabolitů.

Závěr

Studie prokázala, že automatizovaná prekolonová derivatizace s OPA/NIBC a následná UHPLC-FL analýza umožňují efektivní a vysoce citlivé simultánní stanovení 37 D/L-aminokyselin v krátkém čase. Metoda je robustní, snadno implementovatelná do běžných laboratoří a nabízí významné zkrácení doby analýzy bez komplikovaných vícerozměrných sestav nebo drahé detekce MS.

Reference

• Iwata N.; Watabe Y.; Horie S.; Hayakawa Y. Chromatography 2021, 42, 133–141.
• Jin D.; Miyahara T.; Oe T.; Toyo’oka T. Anal. Biochem. 1999, 269, 124–132.
• Ali H.S.; Pätzold R.; Brückner H. Amino Acids 2010, 38, 951–958.