Characterization of polysorbate 80 in (bio)pharmaceuticals using HPLC with charged aerosol detection

Význam tématu

Polysorbate 80 je klíčový neionogenní surfaktant používaný ve farmaceutických a biotechnologických přípravcích pro stabilizaci proteinových formulací. Jeho složitá struktura, tvořená stovkami esterifikačních produktů, vyžaduje spolehlivou analytickou metodu pro charakterizaci a kontrolu kvality v procesech vývoje i rutinní výroby.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie je demonstrovat kvantitativní profilaci skupin molekul Polysorbate 80 (PS80) pomocí RP-HPLC s výkonovou detekcí (charged aerosol detection, CAD) a invertovanou gradientní technikou. Klíčové úkoly:

• Dosáhnout rovnoměrné detektorové odezvy pro různé esterifikační úrovně.
• Optimalizovat linearizaci CAD signálu pro kalibraci v jediném běhu s nižší spotřebou rozpouštědla.
• Odtáčet rušivé složky matrice (histidin, sacharóza) do odpadu za účelem zvýšení robustnosti a produktivity.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda kombinuje reverzní fázovou chromatografii s CAD detektorem ve vedení s invertovaným gradientem. Základní kroky:

• Příprava vzorku: Standardní roztok PS80 (2,5–0,5 mg/mL) a modelová formulace doplněná histidinem a sacharózou.
• Chromatografie: Kolona Accucore C18 (150×2,1 mm, 2,6 μm), mobilní fáze A – 5 mM formiát amonný, pH 4,8; B – isopropanol/acetonitril 50/50 (v/v); tok 0,4 mL/min, teplota kolony 50 °C.
• Invertovaný gradient ve spojení s diverterem: Počáteční část chromatogramu (0–1,3 min) směřuje do odpadu, následně ke CAD detektoru.
• Kvantifikace: CAD signál linearizovaný pomocí výběru optimálního výkonového parametru (PV), kalibrační křivka 5 bodů měřená ve třech opakováních.

Instrumentace

• Vanquish Flex Inverse Gradient LC systém
• Vanquish Charged Aerosol Detector P Series
• Kolona Thermo Scientific Accucore C18 150×2,1 mm, 2,6 μm
• Chromeleon CDS 7.3.2 pro sběr a zpracování dat

Hlavní výsledky a diskuse

Za optimálních podmínek invertovaného gradientu se čtyři skupiny PS80 komponent dobře oddělily podle stupně esterifikace. Odtáčení raných špiček matrice do odpadu zabránilo kontaminaci a zlepšilo opakovatelnost dat. Linearizace CAD signálu při PV 1,8 poskytla nejnižší reziduální chybu (<4 %) a vynikající koeficient determinace (R2 = 0,9997). Sčítáním ploch čtyř skupin byla stanovena čistota modelové PS80 formulace na 96,2 % s nízkými relativními odchylkami (RSD <2,8 %).

Přínosy a praktické využití metody

Metodika umožňuje rychlé a spolehlivé profilování lot-to-lot s nízkou spotřebou organických rozpouštědel a minimalizací zásahů obsluhy. Výhody:

• Vyšší robustnost díky odtáčení matrice.
• Přesná kvantifikace bez nutnosti detekčních labelů.
• Jednorunná kalibrace s lineární odezvou v širokém koncentračním rozsahu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metoda RP-HPLC-CAD s invertovaným gradientem může být dále rozšířena o mass-spectrometrickou detekci pro identifikaci molekulových vzorců. Automatizace přípravy vzorků a integrace s LIMS zvýší průchodnost laboratoře. Rozvoj pokročilých detekčních algoritmů umožní sledovat i minoritní degradanty a kontaminanty.

Závěr

Použití invertovaného gradientu a optimalizovaného CAD linearizačního parametru představuje účinný přístup k charakterizaci komplexních surfaktantů, jako je Polysorbate 80. Získaná data podporují důslednou kontrolu kvality a usnadňují porovnání různých výrobních šarží.

Reference

1. De Pra M. et al., J. Chromatogr. A, 1710 (2023), 464405
2. Thermo Fisher Scientific Application Note 003506, 2025
3. Thermo Fisher Scientific Technical Note 003816, 2025
4. Thermo Fisher Scientific Technical Note 73299, 2019
5. Thermo Fisher Scientific Application Note 73979, 2021