High-sensitive multi-attribute analysis of ADCs under native conditions by using an online multiple heart-cut 2D-LC-HRAM mass spectrometry system

Význam tématu

Antibody-drug konjugáty (ADCs) představují vysoce cílená protinádorová léčiva, kde je klíčové sledovat náboje, poměr náboje k protilátce (DAR) a distribuci náboje (DLD) pro zajištění bezpečnosti, stability a terapeutické účinnosti.
Klasické chromatografické metody, jako SCX a HIC, často využívají MS-nekompatibilní pufry, což omezuje přímou charakterizaci intact mas v hmotové spektrometrii.
Multidimenzionální LC-MS s online desaltingem v druhém rozměru umožňuje mapovat všechny důležité kvalitativní atributy ADC pod nativními podmínkami s vysokou citlivostí.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout dvourozměrnou chromatografii s více srdcovými řezy (multiple heart-cut 2D-LC) spojenou s vysokým rozlišením Orbitrap Exploris 240 MS pro komplexní analýzu cysteinově vázaného ADC polatuzumabu vedotinu pod nativními podmínkami.
Metoda měla umožnit separaci a identifikaci variant náboje, stanovení DAR a rozložení mono- až oktakonjugovaných forem v jediném běhu.

Použitá instrumentace

Thermo Scientific Vanquish 2D UHPLC se srdcovými řezy a pěticí 250µl smyček pro flexibilní sběr frakcí
Thermo Scientific Orbitrap Exploris 240 s Biopharma nastavením pro HRAM MS
SCX kolona ProPac SCX (100×4 mm, 3 µm)
HIC kolona MAbPac HIC-Butyl (100×4,6 mm, 5 µm)
SEC kolona MabPac SEC-1 (300×4 mm, 5 µm)

Použitá metodika

SCX a HIC separace v prvním rozměru s gradientem vhodných amoniumových pufrů a organických modifikátorů
Přepínání frakcí pomocí backflushu pro minimalizaci rozptylu a zlepšení tvaru píků
Desalting a zachování nativního stavu ADC v druhém rozměru pomocí SEC
Přímá inline analýza frakcí Orbitrap Exploris MS s rozlišením 60 000 a cílenou dekonvolucí v BioPharma Finder

Hlavní výsledky a diskuse

SCX-UV chromatografie odhalila 18 nábojových variant, včetně hlavní, kyselých a bazických forem způsobených deamidací, oxidací a ztrátou lyzinu.
HIC-UV separace identifikovala 12 frakcí, z nichž pět hlavních odpovídalo DAR0, DAR2, DAR4, DAR6 a DAR8; průměrná hodnota DAR byla 3,48, v souladu s teoretickou hodnotou 3,4–3,5.
Vysoce citlivá MS detekce umožnila zachytit i nízkomnožné formy jako DAR3+1 linker (abundance 0,43 %) a izomery s rozdílem 128 Da (Lys truncation).
Analýza dekonvolucí odhalila přesné hmotnosti glykoform a modifikací s odchylkou ≤1 ppm.

Přínosy a praktické využití

Integrovaná multiattributová metoda šetří čas a materiál ve výzkumu a QA/QC ADC.
Online desalting eliminuje potřebu offline přípravy a chaotrixních pufrů.
Vysoká citlivost podporuje monitorování stopových nečistot a degradních produktů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření přístupu na další třídy ADC a biokonjugátů.
Automatizace a integrace s pokročilými datovými algoritmy a umělou inteligencí pro rychlejší interpretaci.
Vývoj kvantitativních metod PAT (process analytical technology) pro in-line kontrolu kvality bioprocesů.

Závěr

Vyvinutý online multiple heart-cut 2D-LC-HRAM MS systém umožňuje komplexní, vysoce citlivou charakterizaci ADC pod nativními podmínkami a podporuje spolehlivou kontrolu kvality v bioprodukci.

Reference

• Bobály B. et al. Current possibilities of liquid chromatography for the characterization of antibody-drug conjugates. J Pharm Biomed Anal. 2018;147:493-505.
• Deeks ED. Polatuzumab vedotin: first global approval. Drugs. 2019;79(13):1467-1475.