Analysis of bispecific and multispecific antibody therapeutics using native mass spectrometry on a modified hybrid Orbitrap mass spectrometer

Význam tématu

Bispecifické a multispecifické protilátky představují pokročilé biologické léky schopné současně vázat dva či více antigenů. Díky tomu nabízí nové možnosti cílené imunoterapie, například rekrutaci T-lymfocytů či blokaci signálních drah. Jejich složitá struktura a různorodé glykosylace však klade vysoké nároky na analytické metody, které musí zachovat nativní konformaci bez rozkladných modifikací.

Cíle a přehled studie / článku

Studie se zaměřila na vývoj a ověření nativní hmotnostní spektrometrie (nativní MS) v kombinaci s online výměnou pufru (OBE) pro charakterizaci pěti různých bispecifických protilátek o hmotnostech od 127 do 240 kDa. Cílem bylo prokázat vysokou hmotnostní přesnost, schopnost rozlišení glykoproteoform a sledování agregace či interakcí s jejich antigeny v jediném přístrojovém pracovišti.

Použitá metodika a instrumentace

Online výměna pufru probíhala na koloně NativePac OBE-1 SEC (2,1 × 50 mm) s isokratickou mobilní fází 50 mM amonného octanu. Spektrometrická analýza byla prováděna na hybridním Orbitrap Excedion Pro BioPharma se splitovým měřením až do 12 000 m/z. Optimalizace zdrojových parametrů (in-source CID, teploty, točivého plynného transferu) zajišťovala efektivní desolvaci a přenos molekul do plynové fáze. K získávání dat sloužil software Xcalibur, dekonvoluce proběhla v BioPharma Finder s algoritmem ReSpect.

Hlavní výsledky a diskuse

• Všechny analyzované protilátky byly identifikovány s hmotnostní přesností pod 10 ppm a rozsahem proteoform odpovídajícím modifikacím N-glykosylací.
• Cadonilimab vykázal zvýšenou heterogenitu díky dodatečné glykosylaci na scFv fragmentu, avšak základní rozlišení glykoforem bylo dosaženo v monomerním spektru.
• Bafisontamab (~240 kDa) byl největší molekulou studie a umožnil identifikaci pěti hlavních glykoform s rozptylem 236–241 kDa.
• Analýza tebotelimabu pod tepelným stresem (37 °C, 72 h) odhalila vznik dimeru v relativní ho­doméně 1,4 %.
• Interakce tebotelimabu s antigeny PD-1 a LAG-3 nevedla k vzniku stabilních komplexů, avšak bylo možné sledovat změny v distribuci nábojových stavů naznačující konformační posun.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda kombinuje rychlý přenos vzorku bez nutnosti extenzivní úpravy s vysokým rozlišením a hmotnostní přesností. Umožňuje charakterizovat heterogenní glykoformy, monitorovat agregaci a zkoumat slabé interakce s ligandy. Díky minimální přípravě a krátkému čase analýzy je vhodná pro vývoj a kontrolu kvality nových bispecifických léků.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření rozsahu hmotností a zlepšení citlivosti pro analýzu multispecifických formátů nad 250 kDa.
• Integrace s dalšími separačními technikami (iontová výměnná, kapalinová chromatografie) pro komplexnější profilaci proteoform.
• Automatizace a vysokopropustné platformy pro rutinní nasazení v průmyslové kvalitě.
• Prohloubení studia slabých a přechodných interakcí mezi protilátkami a směrodatnými antigeny.

Závěr

OBE-nativní MS na Orbitrap Excedion Pro BioPharma se ukázala jako robustní a univerzální platforma pro detailní charakterizaci bispecifických a multispecifických protilátek. Metoda poskytuje vysokou hmotnostní přesnost, schopnost rozlišení glykoproteoform, detekci agregátů a sledování interakcí, což otevírá cestu k efektivnímu vývoji a validaci pokročilých biologik.

Reference

1. Li H, Er Saw P, Song E. Challenges and strategies for next-generation bispecific antibody-based antitumor therapeutics. Cell Mol Immunol. 2020;17:451–461. doi:10.1038/s41423-020-0417-8
2. Zhu L, Glick J, Flarakos J. Bioanalytical Challenges in Support of Complex Modalities of Antibody-Based Therapeutics. AAPS J. 2020;22:130. doi:10.1208/s12248-020-00517-1
3. Liu W, Jayasekera HS, Sanders JD, Zhang G, Viner R, Marty MT. Online Buffer Exchange Enables Automated Membrane Protein Analysis by Native Mass Spectrometry. Anal Chem. 2023;95(47):17212–17219. doi:10.1021/acs.analchem.3c02164