Targeted Genomic and Epigenomic Dual Analysis of the Same Region for an Entire Gene in Tumor DNA

Význam tématu

Současné metody celogenomové analýzy genetických mutací a epigenetických změn vyžadují rozsáhlé sekvenování, což je finančně náročné a často nedostačující zejména pro oblasti s vysokým obsahem GC. Cílená dualní analýza na úrovni jediné oblasti genu z jednoho vzorku DNA dokáže snížit náklady, zvýšit rovnoměrnost pokrytí a minimalizovat potřebu dělení vzorku.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vyvinout a vyhodnotit strategii, která umožní současné zjištění genetických variant a metylace ve stejné oblasti genu ARID1A z jednoho vstupního materiálu DNA. Studie srovnala standardní přístup se dvěma panely cílenými na různé oblasti se zmíněnou modifikací, kdy oba panely (pro analýzu DNA a metylace) cílí na tutéž sekvenci.

Použitá metodika a instrumentace

V experimentu bylo použito 10 ng genomové DNA, fragmentované buď sonikací (Covaris) nebo enzymatickou shearovou technikou. Cílené obohacení zajistila souprava Agilent Avida Duo s PCR-free hybridizační chemií. Byly sestaveny dva panely (~90 kb): Watsonova vlákna pro detekci mutací a Crickova pro analýzu metylace. Cílové oblasti se lišily podílem vysoce unikátních (MT) a méně unikátních (LT) sekvencí v poměrech 4:4 a 4:2. Sekvenování proběhlo s alokací 10 milionů párů čtení na DNA panel a 5 milionů párů na metylační panel. Kontrolními standardy byly Avida DNA Focused Cancer Panel a custom metylační panel TMS 200.

Hlavní výsledky a diskuse

• Panely cílené na tutéž sekvenci dosáhly sice nižšího „on-target“ procenta než kontrolní exomové panely (vliv náročných intronických oblastí), ale optimalizovaný poměr 4:2 vedl k lepší selektivitě a výtěžnosti.
• Enzymatická fragmentace zvýšila celkovou obnovu cílových fragmentů, proti tomu mírně snížila procento „on-target“ úchytu ve srovnání se sonikací.
• Míra konverze cytosinu (Avida soft conversion) byla vysoce konzistentní (98,9–99,3 %) bez ohledu na poměr panelů nebo způsob fragmentace.
• Ve čtyřech vysoce kvalitních vzorcích z nádorové tkáně prsu byly detekovány genetické varianty ARID1A (frameshift, stop_gained, missense, synonymní), s mediánovými pokrytími v řádu tisíců násobků. Metylace 1 366 CpG lokalit vykázala výrazné rozdíly mezi vzorky, s mediány pokrytí 97× až 570× a konverzní účinností >99,4 %.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje z jednoho vstupu DNA získat oba typy dat (genetické varianty i metylaci) bez dělení vzorku, což je klíčové pro vzácné či limitované klinické materiály (např. cfDNA, biopsie). Navíc lze samostatně plánovat sekvenační rozpočet pro jednotlivé modality a přizpůsobit podíl unikátních a komplexních regionů cílení podle specifických potřeb studie.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Implementace dalších chemických či hybridizačních modulů pro zvýšení pokrytí GC-bohatých oblastí.
• Rozšíření panelů na celo-genové úrovni s cílenou dualní analýzou specifických genových sad.
• Integrace single-cell či low-input protokolů pro minimalizaci potřeby vzorku při zachování rozlišení multiómických dat.

Závěr

Agilent Avida Duo workflow prokázal schopnost efektivně a ekonomicky detekovat genetické mutace i metylační stavy v rámci téže oblasti genu ARID1A z jediného vzorku DNA. Metoda nabízí vysokou flexibilitu při designu panelů, umožňuje využití různých fragmentačních postupů a je vhodná pro klinický i výzkumný provoz.

Reference

• Tang W.; Zhang F.; Byun J. S.; Dorsey T. H.; Yfantis H. G.; Ajao A.; Liu H.; Pichardo M. S.; Pichardo C. M.; Harris A. R.; Yang X. R.; Figueroa J. D.; Sayed S.; Makokha F. W.; Ambs S. Population-specific Mutation Patterns in Breast Tumors from African American, European American, and Kenyan Patients. Cancer Res. Commun. 2023, 3 (11), 2244–2255. doi:10.1158/2767-9764.CRC-23-0165.