Analysis of Free Drug Content in Antibody-Drug Conjugate Using 2D-LC/Q-TOF/MS

Význam tématu

Antibody-drug conjugáty (ADC) představují moderní třídu cílených protinádorových terapií, kde je cytotoxický malomolekulární lék navázán na protilátku. Kontrola neošetřeného („volného“) léku v přípravku je zásadním kritickým atributem kvality (CQA), protože nevázaný lék může zvyšovat systemickou toxicitu a snižovat bezpečnost léčiva.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout plně automatizovanou a časově úspornou metodu pro separaci a identifikaci volného léku v ADC. Použit byl dvoudimenzionální chromatografický systém kombinující sekvenční vymísťovací SEC (size exclusion chromatography) s reverzní fází (RP) a Q-TOF hmotnostní spektrometrií. Zkrácením manipulací s proteinem a sloučením kroků do jediné 2D analýzy se zvyšuje robustnost a efektivita metody.

Použitá instrumentace

• Chromatografie: Agilent Bio 2D-LC systém, AdvanceBio SEC kolona, Poroshell EC-C18 kolona
• Hmotnostní spektrometrie: Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF se zdrojem Jet Stream ESI
• Software: Agilent MassHunter pro řízení 2D sekvenování a analýzu dat

Použitá metodika

Vzorky ADC byly odsoleny a připraveny v 100 mM acetátovém pufru (pH 7,0) při 5 mg/mL. Do vzorku byly navíc přidány standardy DM1 a SMCC-DM1 (100 µg/mL).

First dimension (SEC):

• Mobilní fáze: 100 mM NH₄OAc / acetonitril (isokraticky 40 % ACN)
• Průtok: 0,25 mL/min, detekce UV při 252 nm

Heart-cutting multi-inject sampling umožňuje vybírat tři po sobě jdoucí frakce se shodným rozsahem 1D chromatogramu (8–10 min) do 40µL kroužků bez fyzické úpravy přístroje. Celkový čas 2D cyklu je 5 min analýza + 0,7 min ekvilibrace.

Second dimension (RP-LC/Q-TOF):

• Kolona: Poroshell EC-C18 při 40 °C
• Mobilní fáze: A = 0,1 % kyselina formiová ve vodě, B = 0,1 % kyselina formiová v 95 % ACN/H₂O
• Gradient: 38 → 65 % B v 5 min, průtok 0,5 mL/min
• MS parametry: pozitivní ESI, 300 °C suspenzní plyn, m/z 100–1700, rychlost 1 spektrum/s, fragmentor 135 V

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace SEC organického modifikátoru ukázala, že 40 % ACN zajišťuje nejlepší tvar píku pro DM1. 1D chromatogram rozlišil vodítko ADC a volný lék, ovšem DM1 a SMCC-DM1 se v přímé separaci překrývaly. Díky multi-cut heart-cutting byly tři frakce přeneseny do 2D RP-LC, kde se analyty úspěšně oddělily a detekovaly:

• DM1: [M+H]^+ = 738,2839 Da (2,30 ppm odchylka)
• SMCC-DM1: dvojitý diastereomerní píky [M+H]^+ = 1072,3985 Da (0,18 ppm)

Automatizace procesu odstranění proteinů a inline přeprava vzorku mezi dimenzemi zkrátila celkový čas analýzy na ~17 min a snížila manuální zásahy.

Přínosy a praktické využití metody

• Kompletní integrace proteinové eliminace a separace volného léku v jediném běhu
• Minimalizace rizika poškození RP kolony adsorpcí proteinů
• Rychlá detekce a kvantifikace volných léků s přesnou hmotnostní identifikací
• Vhodné pro QC oddělení farmaceutických firem pracujících s ADC

Budoucí trendy a možnosti využití

• Aplikace 2D-LC/Q-TOF přístupu na různé typu ADC a jiné biokonjugáty
• Rozšíření heart-cuttingu o vyšší počet frakcí a optimalizace směřování eluátu
• Inline kvantifikace a validace metody pro rutinní kontrolu kvality
• Implementace pokročilých datových algoritmů pro detekci stopových nečistot

Závěr

Popsaná 2D-LC/Q-TOF/MS metoda představuje robustní a plně automatizovaný workflow pro stanovení volného léku v ADC. Spojení SEC heart-cuttingu s RP separací a vysokorozlišovací MS umožňuje rychlou a přesnou analýzu s minimem manuálních kroků.

Reference

1. Li Y. et al. Limiting degradation of reactive antibody drug conjugate intermediates in HPLC method development. J. Pharm. Biomed. Anal. 2014, 92, 114–118.
2. Agilent Application Note 5994-7182EN. Agilent Technologies, 2025.
3. Singh R. et al. A new triglycyl peptide linker for ADCs with improved targeted killing of cancer cells. Mol. Cancer Ther. 2016, 15(6), 1311–1320.