Determination of Protein Extinction Coefficients and Concentration by UV‑Vis

Význam tématu

Stanovení extinkčního koeficientu a koncentrace proteinů pomocí UV-Vis spektrofotometrie je zásadní pro kvalifikaci proteinových interakcí, hodnocení aktivity enzymů a kontrolu kvality biotechnologických produktů, jako jsou monoklonální protilátky a vakcíny.
Kvantitativní a reprodukovatelné měření pomáhá optimalizovat vývoj léčiv, výrobní procesy i finální ověřování shody biosimilárních přípravků.

Cíle a přehled studie / článku

Text se zaměřuje na představení Agilent Cary 3500 Multicell UV-Vis spektrofotometru a příslušného softwaru Cary Workstation pro:

• automatizované stanovení extinkčního koeficientu proteinů podle Beer–Lambertova zákona,
• porovnání aminokyselinového složení inovátoru (Ristova) s dvěma biosimilary (Reditux, Truxima),
• vytvoření kalibrační křivky pro odhad koncentrace protilátek v jednotlivých fázích bioprocesu.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika vychází z měření absorbance vzorků při 280 nm s korekcí na 320 nm jako blank.
Extinkční koeficienty byly určeny dvěma přístupy:

• experimentálně přes UV-Vis měření a vlastní rovnice v softwaru Cary Workstation,
• výpočtem z aminokyselinové sekvence pomocí literárních hodnot extinkčních koeficientů Tyr, Trp a Cys.

Použitá instrumentace

• Agilent Cary 3500 Multicell UV-Vis spektrofotometr
• Cary UV Workstation software
• Ultra-microvolume kyvety (10 mm, 70 µL, Agilent 5062-2496)
• Software pro editaci rovnic a tvorbu kalibračních křivek

Hlavní výsledky a diskuse

Experimentálně naměřené extinkční koeficienty pro lysozym, β-casein, ovalbumin a protilátku Ristova byly v rámci 2–5 % shody s hodnotami vypočtenými ze sekvence.
Biosimilary Reditux a Truxima vykázaly extinkční koeficienty identické s Ristovou při koncentracích 0,5 a 1 mg/mL.
Kalibrační křivka pro Ristovu prokázala vynikající linearitu (R² = 0,9918) v rozsahu 0,1–2 mg/mL.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlé a hromadné stanovení extinkčních koeficientů až pro osm vzorků.
• Automatizace výpočtů zvyšuje reprodukovatelnost a efektivitu laboratoře.
• Možnost sledování koncentrace protilátek v průběhu bioprocesu.
• Analytická hospodárnost díky malým objemům vzorku a snadné kalibraci.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace strojového učení pro predikci struktury proteinů a extinkce.
• Rozvoj miniaturizovaných a multiplexních detekčních systémů pro paralelní analýzy.
• Vývoj online monitorovacích systémů v reálném čase během bioprocesu.
• Kombinace UV-Vis s dalšími spektrometrickými a spektroskopickými technikami.

Závěr

Agilent Cary 3500 Multicell UV-Vis ve spojení se softwarem Cary Workstation poskytuje rychlou, přesnou a vysoce automatizovanou platformu pro stanovení extinkčních koeficientů a koncentrací proteinů.
Metoda prokázala robustnost při charakterizaci inovátoru i biosimilárních protilátek, čímž podporuje analytickou podobnost a kontrolu jakosti v biotechnologickém průmyslu.

Reference

1. Rathore A. S. Follow-On Protein Products: Scientific Issues, Developments and Challenges. Trends in Biotech. 2009;27(12):698–705.
2. Nupur N., Chhabra N., Dash R., Rathore A. S. Assessment of Structural and Functional Similarity of Biosimilar Products: Rituximab as a Case Study. MAbs. 2018;10(1):143–158.
3. Gill S. C., Von Hippel P. H. Calculation of Protein Extinction Coefficients from Amino Acid Sequence Data. Anal. Biochem. 1989;182(2):319–326.
4. Protein Extinction Coefficients and Concentration Calculation, NovoPro Bioscience Inc. https://www.novoprolabs.com/tools/protein-extinction-coefficient-calculation (accessed April 22, 2025).
5. Petrat-Melin B., Andersen P., Rasmussen J. T., Poulsen N. A., Larsen L. B., Young J. F. In Vitro Digestion of Purified Β-Casein Variants. J. Dairy Sci. 2015;98(1):15–26.
6. Lee K. H., Lee J., Bae J. S. et al. Analytical Similarity Assessment of Rituximab Biosimilar CT-P10 to Reference Medicinal Product. MAbs. 2018;10(3):380–396.