Development of a New Gradient Elution Program for the Analysis of Amino Acids in Pet Foods and Plant Proteins

Význam tématu

Analýza aminokyselin je klíčová pro hodnocení nutriční kvality potravinových produktů, včetně krmiv pro domácí mazlíčky a rostlinných proteinů. Hydroxyprolin, významná složka kolagenu, se běžně vyskytuje v živočišných krmivech a slouží jako marker kontaminace či falšování pomocí živočišných složek.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem bylo adaptovat oficiální AOAC metodu 2018.06 pro stanovení aminokyselin tak, aby umožnila spolehlivou separaci a kvantifikaci hydroxyprolinu spolu s dalšími aminokyselinami v krmivech pro mazlíčky a ve vzorcích rostlinných proteinů. Studie zahrnuje vývoj a optimalizaci nového gradientního elučního programu, potvrzení identit píků pomocí hmotnostní spektrometrie a aplikaci metody na reálné vzorky.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda vychází z prekolonní derivatizace AQC (6-aminochinolyl-N-hydroxysukcinimidylkarbamát) a UPLC s UV detekcí.

• Hydrolýza: 24 h při 110 °C v kyselém prostředí nebo alternativně mikrovlnná hydrolýza (160 °C, 20 min).
• Derivatizace: AccQ Tag Ultra borátový pufr a reaktant AQC.
• Chromatografické podmínky: ACQUITY Premier System, AccQ Tag Ultra C18 kolona, detekce při 260 nm, rychlost 0,4 ml/min, teplota kolony 50 °C.
• Gradient: optimalizován pomocí Design of Experiments pro lepší retenci a rozlišení HyPro, XCys a Met.
• MS potvrzení: ACQUITY QDa, režim pozitivní ionizace, rozsah 100–600 Da.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizovaný gradient zajistil baseline separaci (resoluce ≥2) všech sledovaných aminokyselin, včetně hydroxyprolinu a S-2-karboxyetylthiocysteinu (XCys). Sensitivita (LOQ 0,02–0,10 µM) a linearita (R2 ≥0,9975) byly srovnatelné s původní AOAC metodou. Robustnost byla potvrzena DoE testy, kdy odchylky v teplotě kolony (49,3–51,0 °C), průtoku (0,390–0,410 ml/min) a složení mobilní fáze neovlivnily kritické resoluce.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Možnost sledování hydroxyprolinu jako indikátoru živočišných kontaminantů.
• Vysokou spolehlivost a reprodukovatelnost v analýze potravinových aplikací.
• Rychlý a citlivý postup vhodný pro rutinní laboratorní provoz v potravinářské a krmivářské analytice.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj může zahrnovat:

• Integraci MS/MS detekce pro ještě vyšší specifitu.
• Automatizované přípravné systémy pro zkrácení doby analýzy.
• Rozšíření na další typy komplexních matric, např. biotechnologické suroviny.

Závěr

Nový gradientní program úspěšně rozšiřuje AOAC metodu 2018.06 pro analýzu aminokyselin v krmivech pro domácí mazlíčky a rostlinných proteinech. Metoda prokázala vysokou citlivost, linearitu i robustnost a poskytuje spolehlivý nástroj pro kvalitu i výzkum.

Reference

1. Yang J., Liu B., Rainville P.D., Harden S. UPLC-UV Analysis of Amino Acids in Dairy Products – Implementing an International Standard on the ACQUITY Premier System. Waters Corp., 2024.
2. Dong Y.-L. et al. Rapid and Sensitive Determination of Hydroxyproline in Dairy Products Using MEKC-LIF. J. Chromatogr. A, 2012, 1233, 156–160.
3. Yuswan M.H. et al. Food Chem., 2020, 337, 127762.
4. Cohen S.A., Michaud D.P. Synthesis of AQC and Application for HPLC Analysis of Amino Acids. Anal. Biochem., 1993, 211, 279–287.
5. AccQ Tag Ultra Derivatization Kit Care and Use Manual. Waters Corp., Rev. A, 2024.
6. UPLC Amino Acid Analysis Solution System Guide. Waters Corp., 2007.