Automated purification of human antibodies (IgG) on AZURA Bio LC

Význam tématu

Antigeny a protilátky jsou klíčové pro imunitní odpověď a hrají zásadní roli ve výzkumu, diagnostice i farmaceutickém vývoji. Čistota a kvalita IgG je kritická pro spolehlivost imunologických metod, proto je efektivní a opakovatelná purifikace nepostradatelná pro mnoho aplikací.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout plně automatizovaný postup izolace lidských protilátek IgG z krevního séra na systému AZURA Bio LC spojující afinitní chromatografii na protein G a následnou gelovou filtraci za účelem výměny pufru bez nutnosti manuálních zásahů.

Použitá metodika

Bylo použito 500 µl lidského séra. V první fázi byly IgG zachyceny na kolóně HiTrap Protein G (agarózové kuličky s rekombinantním proteinem G). Po odmytí nevyvázaných komponent proběhlo eluování protilátek kyselým pufrem (glycin pH 2.7) a parkování eluátu ve Superloopu. Následovalo automatické přesměrování na kolónu BioFox 40/1200 SEC pro gelovou filtraci (agarózová výplň, výměna pufru zpět na fosfátový pufr pH 7.5). Protokol měl tři hlavní úseky: afinitní chromatografie, parkování a opětovná injekce na SEC, reekvilibraci.

Použitá instrumentace

Systém Knauer AZURA Bio LC s modulárními asistenty a detektory:

• Quaternární pumpa AZURA P6.1.L s odplyňovačem
• UV/VIS detektor UVD 2.1L (280 nm)
• Monitor vodivosti a pH CM 2.1S
• Asistenti pro injekci, výměnu karet, parkování špičky (ASM 2.1L)
• Frakční sběrač FOXY R1

Hlavní výsledky a diskuse

Chromatogram ukázal čtyři charakteristické špičky: nezvázané proteiny, eluovanou IgG z afinitní kolony, eluovanou IgG z gelové filtrace a špičku pufru glycin. SDS-PAGE analýza potvrzuje dvě pásy odpovídající těžkému řetězci (50 kDa) a lehkému řetězci (22 kDa). Z 500 µl séra bylo automaticky izolováno 3.48 mg čisté IgG bez manuálních kroků.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda šetří čas a eliminuje riziko kontaminace spojené s manuální manipulací. Díky modularitě systému lze protokol snadno přizpůsobit pro jiné bílkoviny a objemy vzorku. Vysoká opakovatelnost a automatizace zvyšují produktivitu laboratoří v biotechnologii i farmacii.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj automatizace by mohl zahrnovat inline kvantifikaci proteinu a integraci s masově spektrometrickými nebo chromatografickými detektory. Škálovatelné platformy a robotizované pracovní stanice umožní vysokoprocesní čištění proteinů pro preklinické i klinické aplikace.

Závěr

Plně automatizované spojení afinitní chromatografie na protein G a gelové filtrace na systému AZURA Bio LC prokázalo spolehlivou a efektivní purifikaci lidské IgG bez manuální intervence. Protokol lze široce využít a adaptovat pro různé purifikační úlohy.

Reference

• Janeway CA Jr Travers P Walport M et al Immunobiology The Immune System in Health and Disease 5th Edition Garland Science 2001