A Rapid and Comprehensive UHPLC-MS/MS Clinical Toxicology Research Method for the Analysis of Benzodiazepines in Urine

Význam tématu

Benzodiazepiny představují jednu z nejčastěji předepisovaných skupin psychoaktivních látek s významným potenciálem zneužití. Vyšetření jejich přítomnosti v moči je zásadní pro klinickou toxikologii, forenzní analýzy a monitorování pacientů s rizikem závislosti. Objev nových „designer“ benzodiazepinů, často nelegálně vyráběných s neznámou účinností a toxicitou, dále zvyšuje potřebu citlivých, rychlých a spolehlivých analytických postupů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo navrhnout a validovat výzkumnou UHPLC-MS/MS metodu pro kvantitativní a konfirmační stanovení tradičních a nových benzodiazepinů v moči. Klíčové bylo zjednodušit přípravu vzorku, minimalizovat počet manuálních kroků, zachovat vysoké výtěžky extrakce a dosáhnout rychlého časového rozlišení až 26 sloučenin.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika vychází z následujících kroků a zařízení:

• Vzorek: 100 µl moče, inkubace s β-glukuronidázou.
• Extrakce: Oasis MCX µElution SPE destičky, in-well hydrolýza, kyselinová kondice a jednoduché promytí.
• Eluce: 2×25 µl směsi ACN:MeOH s amoniakem, následná diluce ve 2% ACN/1% kys. mravenčí.
• Chromatografie: ACQUITY UPLC I-Class (FTN) s kolonkou BEH C18 1,7 µm (2,1×100 mm), teplota 40 °C, gradient 0,1% FA ve vodě a ACN, průtok 0,6 ml/min, doba analýzy 4 minuty.
• Detekce: Waters Xevo TQ-S micro, ESI+ režim, MRM přechody pro 26 analytů a vhodné izotopové/internal standardy.
• Software: MassLynx pro akvizici a TargetLynx XS nebo waters_connect QUAN Review pro kvantifikaci.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda zajistila:

• Výtěžnost extrakce 79–102 % (průměr 86 %) se %CV <10 % napříč šesti různými moči.
• Matrixové efekty korekované internal standardy pod 20 % u všech kromě dvou sloučenin.
• Lineární kvantifikaci v rozsahu 5–1000 ng/ml (u některých aminovaných derivátů 10–1000 ng/ml), R² ≥0,990, akceptovatelné bias a variabilita QC vzorků ±15 %.
• Limit kvantifikace 5 ng/ml (10 ng/ml u pěti aminovaných derivátů), S/N >10, bias a %CV <20 %.
• Úspěšné ověření na externích kontrolních vzorcích (UTAK) a proficiency testu (Axio LGC), 71 % výsledků v rámci ±20 % a 93 % do ±30 % cílových hodnot.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí zjednodušenou přípravu vzorku bez přenosu mezi odběrovými nádobami, vysokou propustnost (4min analýza), spolehlivou separaci 26 cílových látek včetně nových designer benzodiazepinů a robustní kvantifikaci vhodnou pro preklinický výzkum, klinická a forenzní pracoviště.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry dalšího rozvoje zahrnují:

• Rozšíření panelu o další nové designer benzodiazepiny a metabolity.
• Automatizaci přípravy vzorku a integraci do robotizovaných platforem.
• Využití pokročilé datové analýzy a AI-podpory pro rychlejší interpretaci výsledků.
• Adaptaci na jiné biopaliva (plazma, sérum, sliny) a vícerozměrnou chromatografii pro zlepšené rozlišení isomerů.

Závěr

Popsaná UHPLC-MS/MS metoda poskytuje komplexní, rychlý a vysoce reprodukovatelný postup pro analýzu širokého spektra benzodiazepinů v moči. Kombinace jednoduché SPE extrakce, krátké doby analýzy a robustní MRM detekce splňuje požadavky klinických i forenzních laboratoří na citlivost, přesnost a propustnost.

Reference

• Brunetti P. et al. Designer Benzodiazepines: A Review of Toxicology and Public Health Risks. Pharmaceuticals. 14:560 (2021).
• European Monitoring Centre for Drugs and Drug Addiction. New benzodiazepines in Europe – a review (June 2021).
• Danaceau J.P., Freeto S., Calton L.J. A Comprehensive Method for the Analysis of Pain Management Drugs and Drugs of Abuse Incorporating Simplified, Rapid Mixed-Mode SPE with UPLC-MS/MS for Forensic Toxicology. Waters Application Note 720006187 (2019).