How to optimize your purification? Your guide for two step purification - principles and system set up

Význam tématu

Dvoukroková purifikace je účinný přístup k izolaci a čištění bílkovin, který automatizuje přechod mezi jednotlivými chromatografickými metodami. Umožňuje odstranit hrubé nečistoty, následně zlepšit čistotu produktu a minimalizovat manuální zásahy, čímž šetří čas a snižuje riziko kontaminace.

Cíle a přehled studie

Článek popisuje principy dvoufázové purifikace a ukazuje tři konfigurace systému založené na zařízení KNAUER AZURA FPLC. Cílem je demonstrovat, jak automatizovat kombinaci dvou chromatografických kroků (např. afinitní zachycení následované dialýzou či gelovou filtrací) a optimalizovat pracovní postupy.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda spočívá v sekvenčním přepínání mezi dvěma kolónami prostřednictvím speciálních ventilů. První kolóna provede „capture“ fázi, zachytí cílový protein a eluat se uloží do smyčky nebo zásobní nádrže. Poté se vzorek přesměruje na druhou kolónu pro dokonalé dočištění („polishing“).

Použitá instrumentace

• FPLC systém AZURA Bio Lab (KNAUER) vybavený biokompatibilními čerpadly
• Vícenástrčkový ventil AVN94CE pro vzorkování
• Ventil pro volbu kolón AVZ52CE
• Výstupní ventil AVS34CE pro přepínání toků
• Senzory tlaku a pro detekci přítomnosti vzduchu
• Frakční sběrač a UV detektor pro sledování elučního profilu

Hlavní výsledky a diskuse

Byly porovnány tři konfigurace:

• Základní nastavení – nejjednodušší, používá hlavní čerpadlo pro vzorky, omezené objemy vzorku
• Varianta se samostatným vzorkovacím čerpadlem – vhodná pro větší objemy, zabraňuje křížové kontaminaci, ale vyžaduje dodatečné čerpadlo
• Rozšířená varianta s dodatkovým smyčkovým ventilem – umožňuje sekvenční či opakované purifikace bez manuálního zásahu, avšak zvyšuje objem mrtvého prostoru

Diskuse ukázala, že volba konfigurace závisí na požadovaném objemu vzorku, toleranci k rozpuštění a dostupné instrumentaci.

Přínosy a praktické využití metody

• Automatizace snižuje dobu manipulace mezi kroky a minimalizuje chyby obsluhy
• Modulární konfigurace lze snadno adaptovat na různé chromatografické principy (IMAC, iontová výměna, gelová filtrace)
• Zkrácení celkového času purifikace a zvýšení reprodukovatelnosti

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj směřuje k vícestupňovým purifikacím s využitím přídavných ventilů a proměnlivých smyček, integraci on-line analytických senzorů (např. měření vodivosti, fluorescence) a k miniaturizaci systémů pro screening malých objemů. V budoucnu lze očekávat širší nasazení v biologickém výzkumu, výrobě biopharmaceutik a ve vysoce propustných platformách.

Závěr

Dvoufázová purifikace na platformě AZURA FPLC představuje efektivní řešení pro rychlou a vysoce čistou izolaci bílkovin. Výběr konkrétní konfigurace závisí na objemu vzorku, požadované flexibilitě a dostupných přístrojích. Díky modularitě lze systém snadno přizpůsobit různým chromatografickým principům a výrobním požadavkům.