Two step purification with a basic set up

Význam tématu

Automatizovaná dvoustupňová purifikace hraje klíčovou roli v bioanalytické chemii a biotechnologiích, protože umožňuje efektivní izolaci proteinů vysoké čistoty s minimem manuálního zásahu. Kombinace selektivní iontové výměny a následného desaltingu zajišťuje odstranění nežádoucích kontaminantů a optimální kvalitu výsledného produktu.

Cíle a přehled studie / článku

Studie popisuje základní nastavení systému KNAUER AZURA Bio Lab pro automatizovanou dvou krokovou chromatografii. Cílem je předvést, jak bez manuální intervence přepínat mezi dvěma kolónami za účelem maximálního obohacení cílového proteinu.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografický systém: KNAUER AZURA Bio Lab (Multi Method FPLC).
• Ventily: multi-injection valve (vzorková smyčka), column selection valve (AVZ52CE, 5 pozic a bypass), outlet valve (8 portů).
• Detekce: UV detektor s prahovou funkcí 60 mAU, konduktometr.
• Frakcionace: fraction collector.
• Pumpy: hlavní pumpa P6.1L, doplňková sample pumpa (SaP).
• Připojovací prvky: PEEK kapiláry, inline filtr 10 µm, tlakový filtr/dummy cartridge, 0,45 µm precední filtrace.
• Software: PurityChrom pro řízení obou metod s časovým řízením a prahováním signálu.

Hlavní výsledky a diskuse

Demonstrace základního zapojení prokázala spolehlivé zachycení eluce z iontově výměnné kolony do vzorkové smyčky a její automatické přesměrování na desalting kolonu. Díky implementaci prahové funkce probíhá selektivní sběr frakcí při překročení 60 mAU, což vede k vysoké čistotě produktu. Jediným omezením je maximální objem zpracovávaného vzorku v injekční smyčce; pro větší objemy je nutné využít hlavní pumpy pro vstřikování.

Přínosy a praktické využití metody

• Plně automatizovaný provoz snižuje časovou a personální náročnost.
• Minimalizuje riziko kontaminace a variabilitu mezi běhy.
• Jednoduchá integrace do stávajících FPLC linek bez zásadních úprav.
• Možnost adaptace kolony a filtrů pro různorodé biomolekuly.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metodiky na tří- a vícekrokové purifikační sekvence.
• Integrace online monitorovacích technik (MS, fluorescenční detekce).
• Přechod k vyšším objemům a paralelnímu zpracování pomocí modulárních systémů.
• Implementace strojového učení pro optimalizaci gradientů a zkrácení doby běhu.

Závěr

Dvoustupňová automatizovaná purifikace za použití systému KNAUER AZURA Bio Lab nabízí efektivní a reprodukovatelný postup pro izolaci proteinů vysoké čistoty. Základní konfigurace slouží jako snadno implementovatelný nástroj pro laboratorní i pilotní aplikace.

Reference

• KNAUER Wissenschaftliche Geräte GmbH. Two step purification with a basic set up. VTN0014, 12/2020.