Unleashing the power of HT-DIA acquisition on Orbitrap Exploris 240 MS – Precise and accurate quantitation at 260 SPD

Význam tématu

Rychlá a přesná kvantitativní analýza proteomů je klíčová pro výzkum biologických procesů, objev biomarkerů a farmakologické studie. Vysokopropustné metody data-independent acquisition (HT-DIA) umožňují zpracovat stovky vzorků denně, přičemž zachovávají vysokou hloubku pokrytí proteomu a reprodukovatelnost dat.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout a otestovat robustní workflow HT-DIA na Orbitrap Exploris 240 spojený s Vanquish Neo UHPLC a μPAC Neo HPLC kolonkou. Porovnaly se tři LC gradienty odpovídající 260, 170 a 100 vzorkům za den (SPD) a zhodnotila se proteomická pokrytí, kvantitativní přesnost, preciznost i mezi-laboratorní reprodukovatelnost.

Použitá metodika a instrumentace

Workflow zahrnovalo:

• UHPLC systém Vanquish Neo s μPAC Neo kolonkou (5,5 cm).
• Gradienty 3,5 min (260 SPD), 5,5 min (170 SPD) a 11 min (100 SPD).
• Orbitrap Exploris 240 se scanováním MS1/MS2 při rozlišení 30 000/15 000.
• DIA šířky oken 16, 10 a 8 m/z s překrytím 1 m/z, NCE 28 %.
• Datová analýza v Spectronaut 18 (DirectDIA+), DIA-NN 1.8.1 a Proteome Discoverer 3.1 s CHIMERYS 2.0, FDR 1 %.

Hlavní výsledky a diskuse

• Proteomické pokrytí: až 6000 proteinu identifikovaných při 100 SPD, okolo 4600 při 260 SPD.
• Kvantitativní preciznost: koeficient variability (CV) proteinů <5 % a peptidů <10 % ve všech režimech.
• Přesnost měření v modelové směsi tří druhů: naměřené poměry 1:1, 1:0,5 a 1:4 velmi blízko teoretickým hodnotám.
• Robustnost: přes 1000 po sobě jdoucích injekcí během 11 dnů bez výměny kolony, RSD proteomického pokrytí 1,37 %.
• Mezi-laboratorní reproducibilita: tři pracoviště (Belgie, Švýcarsko, Německo) dosáhla RSD 4,9–6,7 % v počtu identifikovaných proteinů.

Přínosy a praktické využití metody

HT-DIA workflow na Orbitrap Exploris 240 nabízí:

• Vysokou propustnost vzorků při zachování kvality dat, zásadní pro rozsáhlé kohortové studie.
• Přesnou a precizní kvantifikaci pro detekci i jemných biologických změn.
• Vynikající dlouhodobou stabilitu a mezi-institucionální srovnatelnost, vhodné pro multi-center studie.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s automatizovanými přípravami vzorků a robotizovanými platformami pro další zvýšení propustnosti.
• Propojení s multi-omics přístupy a strojovým učením pro hlubší biologické insighty.
• Optimalizace pro klinické laboratoře a regulované prostředí QA/QC.

Závěr

Popsaný HT-DIA workflow kombinuje rychlé kapalné chromatografii a Orbitrap Exploris 240 MS pro vysoce propustné, přesné a reprodukovatelné proteomické analýzy. Metoda je vhodná pro rozsáhlé studie v oblasti klinického výzkumu, biomarkerů a farmaceutického vývoje.

Reference

Text neobsahuje výslovný seznam literatury.