A Look at Column Choices

Význam tématu

Volba kolony v kapalné chromatografii významně ovlivňuje efektivitu, selektivitu a reprodukovatelnost analýzy. Parametry jako chemie povrchu křemíkového nosiče, velikost pórů a částic, endcaping a výběr pevné fáze určují retenci, rozlišení i životnost kolony. Přechod k technologii superficially porous částic umožnil dosáhnout vysoké efektivity za nižších provozních tlaků, což usnadňuje použití v běžných HPLC i moderních UHPLC systémech.

Cíle a přehled studie / článku

Tento materiál poskytuje přehled faktorů ovlivňujících výběr kolony v LC metodách. Hlavní body:

• Analýza chemie křemíkového povrchu a způsobu vázání organických fází
• Porovnání částic zcela porézních a superficially porous
• Vliv metodických podmínek jako jsou pH a složení mobilní fáze
• Strategie pro vývoj robustních separačních metod
• Hodnocení životnosti kolony

Použitá metodika a instrumentace

• Křemíkové kolony Agilent Poroshell 120 a Zorbax s různými vazbami (C18, C8, Phenyl-Hexyl, PFP, SB-Aq, Bonus-RP, HPH, CN, HILIC)
• Částice superficially porous (typicky 2,7 µm s pevnou jádrovou částicí 1,7 µm a pórovitou vrstvou 0,5 µm)
• Standardní HPLC a UHPLC systémy s provozním tlakem až 1200 bar
• Detekce UV/DAD při 254 nm a 280 nm, gradientní a izokratické režimy
• Mobilní fáze: acetonitril, methanol, vody s pufry (fosfátové, acetátové, formiátové), míchání a úprava pH v rozsahu 1–12

Hlavní výsledky a diskuse

• Superficially porous částice nabízejí až 90 % efektivity sub-2 µm částic při 40–50 % nižším tlaku
• Optimalizace retence prostřednictvím volby pórů (80–120 Å pro malé molekuly, 120–450 Å pro biomolekuly)
• Van Deemterova křivka ukazuje snížení C termu u superficially porous částic, což zlepšuje hmotnostní přenos a rychlost separace
• Široké pH spektrum (1–12) se specifickými fázemi (HPH, Stablebond, SB-Aq) umožňuje analyzovat kyselé i zásadité látky v neionizované formě
• Specifické fázové chemie (PFP, Phenyl-Hexyl, Bonus-RP) poskytují odlišnou selektivitu pro steroidy, beta-blokátory, NSAID a další analyty
• HILIC režim zajišťuje lepší retenci velmi polárních sloučenin jako katecholaminy
• Metodické soupravy pro vývoj (selectivity kit) umožňují rychlé screeningové průchody mezi fázemi
• Porovnání životností kolony ukázalo stabilitu fází při práci na vysokém pH

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšená rychlost analýzy a kapacita laboratoře díky vyšší efektivitě a nižšímu tlaku
• Možnost robustního zpracování širokého spektra látek v jedné koloni s minimální úpravou metod
• Flexibilita při vývoji postupů s využitím různých fází a mobilních fází umožňuje přesně cílit na požadovanou selektivitu
• Snižování variability a špičkového tvaru píků pro lepší kvantifikaci

Budoucí trendy a možnosti využití

• Dopad nanotechnologií a ultrajemných částic pod 2 µm i do rutinních aplikací
• Rozvoj povrchových chemických úprav pro analýzu velkých biomolekul (monoklonální protilátky, proteiny) s fázemi AdvanceBio RP-mAb
• Integrace metod HILIC, RP a iontově párové chromatografie do multidimenzionálních LC systémů
• Automatizovaný vývoj metod s asistencí umělé inteligence pro zrychlené hledání optimálních podmínek

Závěr

Výběr vhodné chromatografické kolony a porozumění jejím parametrům dovoluje maximalizovat efektivitu, selektivitu a životnost separace. Moderní superficially porous technologie a rozšířený výběr chemie pevných fází významně usnadňují vývoj metod od malých molekul po biomolekuly.

Použitá instrumentace

• HPLC/UHPLC systémy Agilent se systémem až do 1200 bar
• Kolony Poroshell 120 řady C18, C8, Phenyl-Hexyl, PFP, SB-Aq, Bonus-RP, HPH, CN, HILIC
• UV/DAD detektory
• Gradientní čerpadla a smyčkové injektory

Reference

Není uvedena specifická literatura; shrnutí bylo vytvořeno na základě interní prezentace Agilent.